孫雨琪，羅千慧，侯俊達(dá)，岑曼益，趙睿明，霍生東

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

消化道蠕蟲感染已經(jīng)對不同的藥物產(chǎn)生了廣泛的抗藥性，這導(dǎo)致了迫切需要新的技術(shù)用于預(yù)防和控制家畜的寄生蟲病。在新的抗蠕蟲藥的研發(fā)上必須要滿足以下要求：使用這些藥物要對人類和野生動(dòng)物不產(chǎn)生毒性或毒性較低，對環(huán)境產(chǎn)生的影響要小，在畜產(chǎn)品中殘留物少。在應(yīng)用這些藥物時(shí)為了達(dá)到預(yù)期的效果，用于控制反芻動(dòng)物消化道蠕蟲感染的新方法已經(jīng)在進(jìn)行中，即將重點(diǎn)放在利用食線蟲真菌控制線蟲的替代策略上[1-4]。通過利用食線蟲真菌對線蟲的生物拮抗來防治動(dòng)物寄生線蟲倍受關(guān)注，食線蟲真菌它成為一類首要的控制有害動(dòng)物線蟲的生物因子,在整個(gè)動(dòng)物控制線蟲的一個(gè)非常重要的位置，是一種寶貴的資源，還沒有被充分認(rèn)識和利用。國內(nèi)對這方面的研究還比較少[5,6],國外利用食線蟲真菌防治動(dòng)物線蟲病已取得了一些進(jìn)展[7-10]。

本研究的目的是探索食線蟲真菌Duddingtonia flagrans當(dāng)?shù)胤蛛x株在谷粒培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，在真空冷凍干燥箱中冷凍干燥不同時(shí)間對含有D. flagrans分離株（SDH035）的培養(yǎng)物中水分含量的影響，為將來該菌株應(yīng)用于家養(yǎng)動(dòng)物寄生線蟲生物防治制劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

食線蟲真菌D. flagrans分離株（SDH035），由西北民族大學(xué)蔡葵蒸教授課題組提供，菌株在4 ℃下2%玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基保存。

1.2 培養(yǎng)基及其制備

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：按照1.5%～2%濃度稱取瓊脂粉于三角燒瓶中，加入蒸餾水，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成倒制平板培養(yǎng)基，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2%麩皮浸出液：稱量20 g麩皮，量取1000 ml蒸餾水，加熱保持微沸狀態(tài)1 h，經(jīng)6層紗布過濾后，置于2 000 mL量筒內(nèi)，并補(bǔ)足至1 000 ml，采用保鮮膜封口置于4 ℃冰箱靜置過夜，吸取上清液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2%麩皮瓊脂培養(yǎng)基（WBA）：在浸出液的基礎(chǔ)上再加入1.5 %～2 %的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成倒制平板培養(yǎng)基。

谷粒聯(lián)合培養(yǎng)基：糧食培養(yǎng)基的總重量為120 g，主要成分是玉米和小麥，其比例是2：1，按照比例稱取小麥和玉米放入500 ml錐形瓶中，再加入0.1%的 KH2PO4、0.05%的 MgSO4以及適量的蒸餾水使得糧食與蒸餾水的比例是1.5：1，用硅膠塞蓋住并用牛皮紙將其瓶口包好，121 ℃高壓滅菌30 min，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZP—250 型）；光學(xué)顯微鏡（Leica DME 型）；倒置顯微鏡（Leica）；解剖針；錐形瓶；燒杯；研缽；漩渦振蕩儀；高速離心機(jī)；真空冷凍干燥箱等。

1.4 厚垣孢子的生產(chǎn)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用2%玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基保存的菌株，在無菌環(huán)境下挑取少量菌絲，接種于WA平板中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d結(jié)束培養(yǎng)。用滅菌過的打孔器切取4 mm×4 mm大小含有菌絲的瓊脂塊，置于2% 液體培養(yǎng)基中，每瓶8塊，置于振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/ min，相對濕度設(shè)為85%，28 ℃培養(yǎng)7 d后終止培養(yǎng)。上述培養(yǎng)物置于旋渦震蕩儀中反復(fù)振蕩10 min，按5%接種量將菌液接種至產(chǎn)孢培養(yǎng)基內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)25 d。終止培養(yǎng)。

1.5 谷粒培養(yǎng)物水分含量的測定

稱取1.4中獲得的含有真菌的谷粒培養(yǎng)物，記錄其質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算出不同冷凍干燥時(shí)間點(diǎn)平皿的質(zhì)量，其谷粒培養(yǎng)物中水分含量計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果

圖1顯示了食線蟲真菌D. flagrans分離株在真空冷凍干燥箱中分別冷凍干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h后，含有厚垣孢子的谷粒培養(yǎng)物中的水分含量。結(jié)果顯示，隨著冷凍干燥時(shí)間的延長，谷粒聯(lián)合培養(yǎng)物中的水分含量逐漸降低，分別為8.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%。

圖2顯示了上述含有食線蟲真菌厚垣孢子的谷粒聯(lián)合培養(yǎng)物在真空冷凍干燥箱中經(jīng)過不同時(shí)間點(diǎn)的冷凍干燥后，冷凍干燥時(shí)間與谷物水分含量之間的關(guān)系。由圖2可知，真空冷凍干燥時(shí)間與谷粒含水量之間呈線性相關(guān)，隨著真空冷凍干燥時(shí)間的延長，谷粒中的水分含量逐漸降低，其R2為0.992，其線性回歸方程為：y=-4.2143x+59.675。

圖1 真空冷凍干燥后谷粒培養(yǎng)物中水分含量測定

3 討論

圖2 真空冷凍干燥時(shí)間與谷粒含水量之間的線性回歸分析

本研究通過對食線蟲真菌D. flagrans分離株在真空冷凍干燥箱中分別冷凍干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h后，含有厚垣孢子的谷粒培養(yǎng)物中的水分含量。結(jié)果證明隨著冷凍干燥時(shí)間的延長，谷粒聯(lián)合培養(yǎng)物中的水分含量逐漸降低，分別為8.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%，且真空冷凍干燥時(shí)間與谷粒含水量之間呈線性相關(guān)，隨著真空冷凍干燥時(shí)間的延長，谷粒中的水分含量逐漸降低，其R2為0.992，其線性回歸方程為：y=-4.2143x+59.675。說明該含有食線蟲真菌D. flagrans分離株的谷粒培養(yǎng)物在真空冷凍干燥的過程中，谷粒含水量受冷凍干燥的時(shí)間所影響，其中干燥時(shí)間越長，谷粒含水量就越低。因此，本研究提示在培養(yǎng)食線蟲真菌D. flagrans的過程中，環(huán)境中的濕度將會(huì)直接影響培養(yǎng)物中的含水量，這一結(jié)果將可能導(dǎo)致培養(yǎng)后期產(chǎn)孢量的變化。