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(1.攀枝花學院 生物與化學工程學院,四川攀枝花 617000;2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術中心,四川攀枝花 617000)

芒果是攀枝花的特產(chǎn),具有纖維少、味甜芳香、質(zhì)地膩滑、香氣怡人、營養(yǎng)豐富的優(yōu)良品質(zhì),集熱帶水果優(yōu)點于一身,被譽為“熱帶水果之王”[1-3]。芒果含糖分較高,口感獨特,將其制成發(fā)酵酒,一方面可保留芒果本身的營養(yǎng)特性,另一方面可使發(fā)酵酒的口感獨具特色。發(fā)酵動力學是探討微生物新陳代謝隨發(fā)酵時間、微生物生長狀況、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物形成的變化規(guī)律的一門科學[4],它把數(shù)學模型運用到發(fā)酵動力學數(shù)據(jù)處理中,用直觀的數(shù)學表達式表示變化規(guī)律,可為發(fā)酵工業(yè)的工藝改進提供理論參考[5]。

目前國內(nèi)外關于芒果發(fā)酵酒及發(fā)酵制品的報道已有很多,如岑濤等[6]從云南芒果上分離酵母菌并用于芒果酒發(fā)酵;王宇鴻等[7]將番木瓜與芒果一起發(fā)酵釀制果醋;王天陸、李善雄等[8-9]分別對芒果發(fā)酵酒的工藝條件通過對比試驗進行了優(yōu)化等。在發(fā)酵動力學研究方面,也有諸對如櫻桃、紅棗等果酒發(fā)酵動力學模型進行研究的報道[10-11]。關于抗氧化性研究,在國內(nèi),普遍采用測定多酚、黃酮、羥基自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率、硫酸氰鐵法等方法測定果酒的抗氧化性[12-16]。目前鮮有關于芒果發(fā)酵酒發(fā)酵動力學及其抗氧化性的相關報道。

本研究通過芒果酒發(fā)酵,根據(jù)發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量、酒精度及總糖含量隨發(fā)酵時間的變化,采用Logistic及TwoSiteComp方程分別建立動力學模型,對動力學模型進行模擬以反映芒果酒發(fā)酵過程的動力學特性,并研究不同酒精度、SO2含量、VC添加量及發(fā)酵時間對芒果酒抗氧化性的影響,以期為芒果酒發(fā)酵工藝提供一定的理論依據(jù),這對芒果資源市場的進一步開發(fā)和擴大具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果 攀枝花市仁和區(qū)農(nóng)貿(mào)市場,品種為“凱特”,產(chǎn)地位于攀枝花市仁和區(qū)中壩;安琪高活性酵母 湖北宜昌安琪酵母股份有限公司;果膠酶(30×104U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;亞硫酸(99.8%)、蘆丁(AR)、沒食子酸(>99.9%) 成都科龍化工試劑廠。

FA2204B電子天平 上海越平科學儀器有限公司;PHS-2C酸度計 天津市賽得利斯試驗分析儀器;LB32T手持式糖度儀 廣州市銘睿電子科技有限公司;DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;0-25型酒精計 衡水市博衡儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點 芒果酒發(fā)酵工藝流程如下所示[17]。

操作要點:原料預處理:芒果破碎、去核,并將去核芒果放入榨汁機榨汁;SO2、果膠酶的添加:芒果汁中加入60 mg/L的二氧化硫以防止雜菌污染,并加入40 mg/L果膠酶在40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中酶解24 h以分解果膠,增加出汁率;成分調(diào)整:發(fā)酵前要對芒果汁進行糖度、酸度調(diào)整。實驗需要對不同酒精度的芒果酒進行抗氧化性測定,通過初始加入不同白砂糖量調(diào)節(jié)糖度,發(fā)酵進行酒精度調(diào)整;加入檸檬酸調(diào)節(jié)酸度為4.5 g/L,同時加入接種酵母。發(fā)酵:發(fā)酵期間,發(fā)酵外環(huán)境溫度為室溫(15 ℃左右),在20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d;陳釀:陳釀時需加入100 ppm/L的二氧化硫以殺死菌體。

1.2.2 芒果酒發(fā)酵過程中理化與菌種量的變化 測定芒果酒中多酚、黃酮含量及羥基自由基清除率時,固定SO2添加量為60 mg/L,VC添加量為120 mg,通常17～18 g/L的糖分可轉(zhuǎn)為1°酒精,通過初始加入白砂糖量分別為85、120、150、190、220 g/L,在發(fā)酵過程中對酒精度進行檢測,控制發(fā)酵時間,獲得不同酒精度為5%、7%、9%、11%、13%;固定酒精度為11%,VC添加量為120 mg,發(fā)酵7 d,設定SO2添加量為60、80、100、120、140 mg/L;固定SO2添加量為60 mg/L,酒精度為11%,發(fā)酵7 d,設定不同VC添加量為30、75、120、165、210 mg;固定SO2添加量為60 mg/L,VC添加量為120 mg,酒精度為11%,設定不同發(fā)酵時間為0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168 h。在發(fā)酵的7 d時間內(nèi)每隔12 h對發(fā)酵過程中的酒精度、總糖、pH及酵母菌數(shù)量進行測定。

1.2.2.1 酒精度的測定 采用蒸餾法,用酒精計測量其酒精含量。

1.2.2.2 總糖含量的測定 采用菲林試劑法[18]。

1.2.2.3 pH的測定 采用pH計進行測定。

1.2.2.4 酵母菌數(shù)量測定 采用血球計數(shù)板法測定。

1.2.3 芒果酒發(fā)酵過程中抗氧化指標的變化 在進行抗氧化指標變化的測定時,酒精度、SO2添加量、VC添加量及發(fā)酵時間的變化水平與1.2.2中所描述的變化水平相同。

1.2.3.1 黃酮含量的測定 蘆丁標準曲線的繪制[19-20]:用分析天平準確稱取蘆丁10.26 mg,加入30%乙醇,定容至50 mL,得蘆丁母液(1 mL中含有0.2052 mg蘆丁)。準確吸取蘆丁母液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別加入5只25 mL容量瓶中,向每只容量瓶中依次加入5%的硝酸鈉溶液1 mL,10%的硝酸鋁溶液1 mL,1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,定容,搖勻后靜置15 min,測定吸光度值,用Origin 8.6軟件繪圖,得標準曲線和回歸方程式。根據(jù)蘆丁的線性回歸方程和樣液的吸光值,計算樣液的黃酮含量。

1.2.3.2 多酚含量的測定 沒食子酸標準曲線的繪制[21-23]:用分析天平精確稱取(0.110±0.001) g的焦性沒食子酸,用水定容至100 mL,得濃度為1000 mg/L的沒食子酸母液;從沒食子酸母液中分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL到5只100 mL容量瓶中,定容至刻度,得0、10、20、30、40、50 mg/L的沒食子酸標準溶液。分別吸取1 mL沒食子酸標準溶液,在其中加入5 mL水,1 mL福林酚試劑,3 mL 7.5% NaCO3溶液,得0、1、2、3、4、5 mg/L的沒食子酸,在765 nm處測定其吸光度值,運用Origin 8.6軟件進行繪圖,得標準曲線和回歸方程式。根據(jù)沒食子酸的線性回歸方程和樣液的吸光值,計算樣液的多酚含量。

1.2.3.3 羥基自由基清除率的測定 在1 mL芒果酒試液中,依次加入0.1 mL 0.3%雙氧水和1.5 mL 1.8 mmol/L的水楊酸-乙醇和2 mL 1.8 mmol/L的硫酸亞鐵,混勻,37 ℃恒溫水浴30 min,以蒸餾水代替芒果酒試液作為對照,測定510 nm處的吸光值[24-25]。羥基自由基(OH·)清除率的計算公式為:

式(1)

式中:A1為蒸餾水代替芒果酒試液的吸光值;As為加了芒果酒試液的吸光值。

1.2.4 發(fā)酵動力學模型的建立 Logistic模型是一個相當經(jīng)典的“S”型曲線方程,常應用于發(fā)酵的細胞生長過程[26]。

1.2.4.1 酵母菌生長動力學模型 根據(jù)實驗的數(shù)據(jù)分析,果酒酵母的生長呈“S”型的曲線,可以用Logistic模型來進行描述:

式(2)

式中:Y表示發(fā)酵液中總糖含量,%;A1表示酵母菌的最初濃度,%;A2表示酵母菌的最終濃度,%;X表示發(fā)酵時間,h;X0、P為方程系數(shù)。

1.2.4.2 產(chǎn)物酒精生成動力學模型 本實驗采用蒸餾法測定發(fā)酵液中酒精度,依據(jù)試驗數(shù)據(jù),應用Origin 8.6軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行畫圖,描述酒精度含量隨發(fā)酵時間的變化趨勢。方程為:

式(3)

式中:Y表示發(fā)酵液中的總糖含量,%;X表示時間,h;A1表示酒精的最初濃度,%;A2表示酒精的最終濃度,%;X0、p表示方程中的系數(shù)。

1.2.4.3 總糖消耗動力學模型 芒果酒發(fā)酵過程中,發(fā)酵液中糖主要供給酵母菌利用,用于酵母菌的生長繁殖,維持酵母的正常新陳代謝,用下面的方程來擬合總糖消耗的變化過程:

式(4)

式中:Y表示發(fā)酵液中的總糖含量,%;X表示時間,d;A1為發(fā)酵液中總糖的最大含量,%;A2表示發(fā)酵液中的總糖的最小含量,%;其它表示方程中的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果酒中菌體量、酒精度、總糖含量、pH的變化情況

芒果酒發(fā)酵過程中菌體量、酒精度、總糖含量、pH隨發(fā)酵時間的變化趨勢見圖1。由圖1可知,0～36 h期間,酵母菌處在適應新環(huán)境階段,生長緩慢,糖的消耗也較慢,酒精生成量較少,pH迅速下降,此階段為適應期;36～108 h期間,酵母菌迅速增長,糖迅速被利用,酒精生成速率快,48 h之后pH有緩慢上升;108～168 h期間,酵母菌生長基本停止,酒精生成速率變慢,糖基本沒有消耗,pH趨于穩(wěn)定。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液酒精度為11.4%,總糖含量為2.3%左右,pH為3.74。從圖中變化曲線可以看出,總糖的消耗和酒精的生成符合酵母菌生長代謝規(guī)律。

圖1 芒果酒發(fā)酵過程主要指標變化曲線Fig.1 Change curves of main indexes of Mango wine fermentation process

2.2 芒果酒抗氧化性

2.2.1 標準曲線

2.2.1.1 蘆丁標準曲線 在510 nm處測得的蘆丁標準曲線如圖2所示。蘆丁的標準曲線方程為:Y=5.71916X-0.00919,R2=0.99293,相關性較好,可用于計算芒果酒中黃酮的含量。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.2.1.2 沒食子酸標準曲線 在765 nm處測得的沒食子酸標準曲線如圖3所示。沒食子酸的標準曲線方程為:Y=0.025X-9.5238,R2=0.99631,相關性較好,用于計算芒果酒中多酚的含量。

圖3 沒食子酸標準曲線Fig.3 Standard curve of gallic acid

2.2.2 不同酒精度對芒果酒抗氧化性的影響 由表1可以看出芒果酒在發(fā)酵過程中當酒精度為5%～7%時,黃酮、多酚含量有所增加,羥基自由基清除能力也隨著增加,當酒精度為9%時,羥基自由基清除能力最強,當酒精度>9%時,羥基自由基清除能力反而減弱。與酒精度為9%時相比,當酒精度達到13%時,OH自由基清除能力下降了23.6%,抗氧化能力幾乎減弱一半,黃酮含量下降了9.3%,多酚含量減少了11.1%,隨著芒果酒中黃酮和多酚含量的下降,抗氧化能力隨之減弱?？寡趸芰ψ兓脑蚩赡苁桥c黃酮的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有關,促進電子的離域化,有利于供氫體在提供氫后形成相對穩(wěn)定的自由基中間體,從而抗氧化能力得到加強。而多酚的抗氧化能力的強弱由它的化學結(jié)構(gòu)有密切關系決定。它的聚合度越高,抗氧化能力就越強?？寡趸芰p弱的原因可能是由于糖苷的取代位置不同,對氧化活性有差異,糖苷基的引入均會降低其抗氧化能力。而多酚的聚合度隨著酒精含量的增加而降低,其抗氧化能力也隨著減弱。

表1 酒精度對黃酮、多酚含量以及OH·清除率的影響Table 1 Effects of alcohol content on flavonoids,polyphenols content and OH· scavenging rate

2.2.3 不同SO2濃度對芒果酒抗氧化性的影響 由表2可知,隨著SO2濃度的增加,黃酮含量逐漸減少,多酚含量先下降再上升再下降,羥基自由基的清除能力也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當添加量為100 mg/L時,多酚含量和羥基自由基的清除率達到最高,分別為0.058 mg/mL、69.01%。隨后,多酚的含量逐漸減少,羥基自由基的清除能力減弱。主要原因可能是SO2能與果酒中的有機過氧化物的發(fā)生反應,導致芒果酒中沒有過氧化氫等強氧化性物質(zhì)生成,同時過氧化酶也不能發(fā)揮其活性。

表2 二氧化硫?qū)S酮含量、多酚含量和OH·清除率的影響Table 2 Effects of SO2 on flavonoids content,polyphenols content and OH· scavenging rate

2.2.4 不同維生素C添加量對芒果酒抗氧化性的影響 由表3可知,黃酮含量在VC加入量為30 mg時最高,為0.099 mg/mL,在VC加入量為75 mg時最低,為0.028 mg/mL,整體上黃酮含量隨VC加入量的增加而降低;多酚含量在VC加入量為75 mg時最低,為0.028 mg/mL,當VC加入量為165 mg時,多酚含量達到最高,為0.066 mg/mL;OH自由基的清除能力隨VC加入量的增加呈現(xiàn)上升趨勢,當VC加入量在210 mg時,OH自由基清除率達到最高,為68.35%。過量的VC使黃酮和多酚的含量下降,OH自由基清除率卻并沒有多大變化,由此可見過量的VC可能會對芒果酒的抗氧化性造成抑制作用。當加入VC的量為165 mg時,芒果酒的抗氧化作用達到最強。

表3 維生素C添加量對黃酮含量、多酚含量以及OH·清除率的影響Table 3 Effects of vitamin C on flavonoids content,polyphenols content and OH· scavenging rate

2.2.5 不同發(fā)酵時間對芒果酒抗氧化性的影響 由表4可以看出,發(fā)酵0～24 h時多酚與黃酮含量有所降低,在24～84 h期間,隨著發(fā)酵時間的增加,黃酮與多酚含量以及清除羥基自由基的能力逐漸上升,在84 h均達到最高值。分別為0.416、0.096 mg/mL和67.6%,隨后隨著發(fā)酵時間的增加,黃酮、多酚含量及OH自由基清除率整體上有所下降。下降的主要原因,可能是因為含有大量的可氧化基團。發(fā)酵過程中,多酚會造成芒果酒中高級醇的氧化和多酚類物質(zhì)相互間發(fā)生氧化聚合反應,隨著發(fā)酵的不斷進行,多酚發(fā)生聚合、氧化反應,使芒果酒中多酚含量不斷下降,從而其抗氧化性也不斷減弱。綜合考慮各因素,當發(fā)酵時間在84 h時,芒果酒的抗氧化能力最好。

表4 發(fā)酵時間對黃酮、多酚含量以及OH·清除率的影響Table 4 Effects of fermentation time on flavonoids,polyphenols content and OH· scavenging rate

2.3 芒果酒發(fā)酵過程模型建立

2.3.1 酵母菌生長動力學模型的建立 用Origin 8.6軟件對式(2)進行數(shù)據(jù)擬合,計算得式(2)中A1=5.5980,A2=14.169,X0=57.666,P=3.9710,據(jù)此得酵母菌增長隨發(fā)酵時間變化的表達式為:

式(5)

通過Origin 8.0軟件對試驗結(jié)果分析,酵母的生長擬合曲線如圖4所示。由圖4可知,發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量隨發(fā)酵時間的變化曲線與其擬合曲線的吻合程度好,芒果酒發(fā)酵過程中的Logistic模型R2=0.99819,表明該模型基本上反映了酵母菌的生長變化情況。

圖4 酵母菌生長實驗值與預測值模型擬合曲線Fig.4 Fitness curve of test values ofyeast growth and prediction values

2.3.2 酒精生成動力學模型的建立 酒精發(fā)酵實質(zhì)上就是酵母菌通過分解葡萄糖等有機物,產(chǎn)生酒精、二氧化碳等不徹底氧化產(chǎn)物的過程。實驗通過對發(fā)酵過程中酒精度的測定,用Origin 8.6軟件對式(3)進行數(shù)據(jù)擬合,計算得式(3)中A1=0.19863,A2=12.0780,X0=66.7082,P=3.473,據(jù)此得到酒精度隨時間變化的表達式為:

式(6)

酒精生成擬合曲線如圖5所示。由圖5可知,芒果酒發(fā)酵過程中酒精生成動力學模型的預測值和實測值的平均相對誤差較小,酒精生成量的擬合值曲線和實測值曲線吻合較好。Origin 8.0軟件分析可知,芒果酒發(fā)酵過程中的酒精生成動力學模型R2=0.99810,表明該模型能很好地反映隨發(fā)酵時間酒精度的變化情況。

圖5 酒精生成實驗值與預測值模型擬合曲線Fig.5 Fitness curve of test values of alcohol production and prediction values

2.3.3 總糖消耗動力學模型的建立 實驗通過對發(fā)酵過程中芒果汁液中總糖含量的測定,用Origin 8.6軟件對式(4)進行擬合,計算得式(4)中A1=12.46893,A2=2.30008,lgx1=2.29461,lgx2=3.86362,f=0.80826。得總糖含量隨時間變化的方程為:

式(7)

總糖消耗擬合曲線如圖6所示。由圖6可知,在芒果酒發(fā)酵過程前期、中期和后期的總糖含量測定值曲線和總糖消耗動力學模型的擬合值曲線吻合度很好。芒果酒發(fā)酵過程中的TwoSiteComp模型R2=0.99619,表明總糖含量的動力學模型能很好地反映隨發(fā)酵時間總糖含量的變化情況。

圖6 總糖消耗實驗值與預測值模型擬合曲線Fig.6 Fitness curve of test values of total sugar consume and prediction values

3 結(jié)論

在芒果酒的發(fā)酵過程中對理化和菌量進行了測定,芒果酒發(fā)酵過程中菌體量、酒精度、總糖含量、pH均隨著發(fā)酵時間的增加而呈現(xiàn)一定的變化趨勢,發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液酒精度為11.4%,總糖含量為2.3%左右,pH為3.74;芒果酒的抗氧化性分析結(jié)果表明,當酒精度為9%時,黃酮含量、多酚含量、羥基自由基清除率分別達到最高,分別為0.09、0.021 mg/mL、52.82%;當SO2濃度為100 mg/L時,羥基自由基清除率達到最高,為69.01%;當加入VC的量為165 mg時,多酚含量最高,為0.066 mg/mL,發(fā)酵時間在84 h時,芒果酒的黃酮含量、多酚含量、羥基自由基清除率達到最高,分別為0.416、0.096 mg/mL、67.6%。本實驗采用Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,用Logistic方程建立了芒果酒發(fā)酵的菌體生長、產(chǎn)酒精、總糖消耗的動力學模型并得到模型擬合方程,其決定系數(shù)R2分別為0.99819、0.99810、0.99619,均大于0.9。動力學模型的預測值曲線與實測值曲線的吻合程度均很好,表明動力學模型能夠準確地描述芒果酒發(fā)酵過程的變化。

通過芒果酒發(fā)酵動力學及抗氧化性的研究,將進一步掌握酵母菌的生理特征,酒精生產(chǎn)的最適條件,以及各發(fā)酵參數(shù)之間的關系,為今后工業(yè)化生產(chǎn)芒果酒提供一定的理論參考。