石新東，胡勝，馮軍

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，因手術(shù)全切困難、放射治療并發(fā)癥多、復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1]。Co60放射治療是高級(jí)別膠質(zhì)瘤綜合療法的有效手段之一。但Co60照射后可能導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷和并發(fā)癥，特別是放射性腦水腫（radioactive cerebral edema，RCE）。目前有關(guān)Co60照射治療膠質(zhì)瘤后RCE程度與癌癥相關(guān)基因表達(dá)水平之間關(guān)聯(lián)性的研究報(bào)道較少。部分具有酪氨酸蛋白激酶活性的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)、凋亡，廣泛影響組織代謝、微血管活性、血腦屏障穩(wěn)定性等。erb-B基因編碼物是具有典型酪氨酸蛋白激酶活性的細(xì)胞因子，其成員包括erb-B1，即表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），erb-B2-4[2]。EGFR基因表達(dá)物與膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別和輻射耐受性均密切相關(guān)[3]。本研究探討Co60治療后RCE的發(fā)生程度與erb-B1轉(zhuǎn)錄水平的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。

1材料與方法

1.1 主要試劑與材料

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞（購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室）。8周齡雄性SD大鼠40只（購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心），體質(zhì)量250～300 g。高糖DMEM培養(yǎng)基（購(gòu)于Hyclone公司），小牛血清（購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選取C6細(xì)胞，以1×103/μL濃度接種于50 mL培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的高糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)培養(yǎng)瓶約80%滿時(shí)，以0.25%胰酶消化，離心，棄上清，用Hank’s液調(diào)成細(xì)胞濃度為1×105/μL的單細(xì)胞懸液

1.2.2 膠質(zhì)瘤大鼠模型制作[4]水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定于江灣Ⅰ型腦立體定位儀上，常規(guī)消毒，于頭頂中線處縱向切開(kāi)頭皮，長(zhǎng)約1 cm；于前囟處矢狀縫右側(cè)旁開(kāi)3.0 mm，冠狀縫前1 mm處用圓頭牙鉆鉆孔，孔徑1.2 mm，微量注射器垂直進(jìn)針，深度為皮質(zhì)下5 mm（右側(cè)尾狀核附近）；緩慢注入取15 μL（1×105個(gè)/μL）C6混懸液；封閉骨窗，縫合切口。術(shù)后定期消毒皮膚，肌注青霉素（1萬(wàn)U/只，1次/d，共2 d）。

1.2.3 分組及治療治療 大鼠種植C6細(xì)胞15 d后，將成瘤大鼠（有明顯左側(cè)肢體偏癱）隨機(jī)分為對(duì)照組10只，放療組30只。放療組大鼠常規(guī)麻醉后，每3只1組，俯臥位放置，用Co60行全腦照射，照射劑量為18 Gy（3 Gy/min），初次照射3 min，12 h后再次照射3 min，總計(jì)照射6 min[5]。對(duì)照組不予任何治療。

1.2.4 標(biāo)本采集 Co60照射后第6天，麻醉后處死所有大鼠，取出全腦，取腫瘤組織進(jìn)行Trizol消化。

1.2.5 RT-PCR ①引物：erb-B1上游引物：5’CTTCTTGCAGCGATACAGCTC 3’，下游引物：5’ATGCTCCAATAAATTCACTGC 3’，上下游引物均跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)，避免DNA的干擾，擴(kuò)增片斷大小441 bp。β-actin上游引物：5’TAAGCTGTGCTCGCGCTACTC TCTC，下游引物：5’GTCGGATTGATGAAACCCAGA CACA3’，擴(kuò)增片斷大小168 bp。②逆轉(zhuǎn)錄cDNA。Trizol提取含瘤腦組織mRNA，取1 μg做逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：RNA 1 μg、M-MLV RT 1 μL（200 U）、M-MLV 5×Reaction Buffer 5 μL、RNasin 0.5 μL、Oligo（dT）2 μL（1μg）、4×dNTP 5 μL，DEPC處理水補(bǔ)至終體積25 μL，37℃孵育60 min。③PCR。循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。④電泳：記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后圖像，并選用Band Leader解析圖像。

1.2.6 腦組織HE染色 3組均在肉眼下剔除腫瘤之后將剩余右側(cè)大腦半球腦組織進(jìn)行石蠟包埋，制作4 μm切片，常規(guī)法行HE染色。

1.2.7 腦水腫檢測(cè) 采用HMIAS-2000圖象分析儀掃描分析HE染色切片，用光標(biāo)儀測(cè)量水腫組織面積。每只大鼠隨機(jī)測(cè)量4張切片，每片選擇5個(gè)不重復(fù)的高倍視野，計(jì)算水腫面積平均百分率（水腫組織面積占視野面積平均百分率）。放療組水腫面積平均百分率＞30%的，定義為“明顯腦水腫”；＜10%的，定義為“無(wú)腦水腫”；10%～30%的大鼠剔除[7]。觀察水腫組織形態(tài)及分布特點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 水腫組織形態(tài)與分布

放療組中，明顯腦水腫12只，無(wú)腦水腫11只，明顯腦水腫率為40%（12/30）。明顯腦水腫大鼠的腦水腫組織呈帶條狀或團(tuán)塊狀，分布較集中，見(jiàn)圖1A；無(wú)腦水腫大鼠的腦水腫組織呈雪花狀，較局限，見(jiàn)圖1B；對(duì)照組大鼠的腦組織水腫組織散在不均勻分布，見(jiàn)圖1C。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色（光學(xué)顯微鏡，×200）

2.2 RT-PCR

從大鼠腦瘤組織中成功地?cái)U(kuò)增出EGFR（即erb-B1）和β-actin的PCR產(chǎn)物，見(jiàn)圖2。mRNA轉(zhuǎn)錄水平半定量分析結(jié)果顯示，放療組明顯腦水腫大鼠erb-B1轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組和放療組無(wú)腦水腫大鼠（均P＜0.01），放療組無(wú)腦水腫大鼠與對(duì)照組大鼠的erb-B1轉(zhuǎn)錄水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖2 RT-PCR條帶

表1 各組大鼠腦組織erb-B1轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織erb-B1轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

組別對(duì)照組放療組無(wú)腦水腫大鼠放療組明顯腦水腫大鼠只數(shù)101112 erb-B1轉(zhuǎn)錄水平0.710736±0.057259①0.738544±0.045348①0.925237±0.064943

3討論

有研究采用SABC法來(lái)研究放射性腦水腫的發(fā)生與erb-B1（EGFR）基因表達(dá)水平的關(guān)系[5]。SABC法是蛋白水平的研究，只有具備正常膜外段的erb-B1才能和相應(yīng)抗體結(jié)合而被檢測(cè)出來(lái)。但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中erb-B1表達(dá)異常，既有表達(dá)數(shù)量的異常、也有質(zhì)量的異常--膜外段發(fā)生畸變[6,7]。因此，SABC法不能全面、精確地揭示膠質(zhì)瘤患者EGFR基因表達(dá)程度。RT-PCR法是檢測(cè)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，其靈敏度是SABC法的1000倍以上，且本研究選擇EGFR在轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)穩(wěn)定的區(qū)段來(lái)進(jìn)行引物設(shè)置進(jìn)行RT-PCR。可以更全面、精確地反映膠質(zhì)瘤細(xì)胞erb-B1基因的生物活性。

本實(shí)驗(yàn)C6膠質(zhì)瘤荷瘤大鼠模型與人體顱內(nèi)高級(jí)別膠質(zhì)瘤具有很高的相似性，回轉(zhuǎn)式Co60放射儀也是臨床上常用的放療設(shè)備之一。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)于臨床診療工作和科學(xué)研究均具有可靠的參考價(jià)值。從本研究相關(guān)指標(biāo)的比較發(fā)現(xiàn)，放療組明顯腦水腫大鼠的erb-B1轉(zhuǎn)錄水平性明顯高于無(wú)腦水腫大鼠。erb-B1轉(zhuǎn)錄水平越高，發(fā)生RCE的可能性越大，發(fā)生RCE的程度越重，因此高級(jí)別膠質(zhì)瘤Co60放療后RCE發(fā)生情況可能與含瘤腦組織erb-B1的異常轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

膠質(zhì)瘤Co60治療后RCE的發(fā)生程度受個(gè)體輻射耐受性的影響[8]，而輻射敏感性與腫瘤惡性級(jí)別密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤的惡性度與多種致癌-抑癌基因的表達(dá)異常有關(guān)，其中癌基因erb-B1過(guò)表達(dá)是常見(jiàn)方式之一。相關(guān)研究證實(shí)，膠質(zhì)瘤的放射敏感性與瘤細(xì)胞erb-B1表達(dá)水平密切相關(guān)[9,10]。致癌-抑癌基因表達(dá)、膠質(zhì)瘤惡性程度及放射敏感性，相互影響、彼此關(guān)聯(lián)。因而erb-B1可通過(guò)異常表達(dá)來(lái)改變膠質(zhì)瘤的惡性級(jí)別，進(jìn)而改變腫瘤的放射敏感性，最終影響RCE的發(fā)生。最新研究顯示erb-B1通路底物EPS8可以通過(guò)改變血-腦脊髓屏障來(lái)影響腦水腫的發(fā)生[11]。表皮生長(zhǎng)因子受體通路底物8（Eps8）是表皮生長(zhǎng)因子受體重要的激酶活性底物之一。Eps8參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、胃腸癌等多類型腫瘤細(xì)胞的有絲分裂、分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移[12]，并與腫瘤的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。Eps8可以通過(guò)改變?cè)谀X脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)纖維型肌動(dòng)蛋白在血-腦脊髓屏障的分布[13]，進(jìn)而影響血-腦脊髓屏障功能，這是放射性腦水腫發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)[14]。因而，erb-B1可能通過(guò)調(diào)節(jié)EPS8來(lái)改變血-腦脊髓屏障功能，進(jìn)而直接影響RCE的發(fā)生。

膠質(zhì)瘤放療后RCE主要是通過(guò)激素、脫水藥物等進(jìn)行防治，本研究為膠質(zhì)瘤RCE的防治和放射劑量的選擇提供了新的途徑和理論依據(jù)。膠質(zhì)瘤患者放療前后可以通過(guò)阻斷、抑制EGFR的表達(dá)或降低EGFR的生物活性，積極主動(dòng)地防治放射性腦水腫。對(duì)于EGFR高表達(dá)的患者，適當(dāng)降低放射劑量同時(shí)加用抑制EGFR表達(dá)的藥物，可以避免致死性RCE的發(fā)生。對(duì)于EGFR低表達(dá)的患者，適當(dāng)增大放射劑量，既可以增強(qiáng)放療療效果又不會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的RCE。

除了EGFR，erb-B基因家族還有2-4亞型，目前還無(wú)法確定erb-B2-4亞型在高級(jí)別膠質(zhì)瘤放射治療后RCE形成中扮演何種角色，還需進(jìn)一步深入研究。