李云云，李 強(qiáng)，余宏軍，蔣衛(wèi)杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜是我國(guó)保護(hù)地生產(chǎn)中栽培面積最大的蔬菜作物之一，其維生素、礦質(zhì)元素及其他營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富，抗壞血酸（AsA）和可溶性糖含量是黃瓜果實(shí)重要的品質(zhì)指標(biāo)。研究表明，蔬菜的AsA和可溶性糖含量受到生物學(xué)特性、環(huán)境條件和施肥等因素影響，其中氮素營(yíng)養(yǎng)供給是調(diào)控其含量變化的重要栽培措施之一。研究發(fā)現(xiàn)在菠菜［1］、生菜［2］、白菜［3］等葉菜類蔬菜中，不同氮素供給水平可以顯著影響蔬菜葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、有機(jī)酸、AsA等物質(zhì)的含量，隨著氮素供給水平的提高，蔬菜風(fēng)味品質(zhì)明顯下降，可溶性糖、AsA含量并沒有隨著氮素供給的增加而增加，相反在低濃度氮素供給水平下，其可溶性糖和AsA含量提高，風(fēng)味品質(zhì)改善。劉玉梅等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在黃瓜栽培中也有相同現(xiàn)象，氮肥過量施用會(huì)引起黃瓜果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)下降（可溶性糖含量、可溶性固形物減少），低濃度氮素供給條件下，黃瓜幼苗葉片中可溶性糖含量和AsA含量增加［5-6］，但是低氮供給對(duì)黃瓜果實(shí)中可溶性糖和AsA含量的影響及其調(diào)控還鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)通過營(yíng)養(yǎng)液栽培方式對(duì)黃瓜進(jìn)行短期低氮處理，探究黃瓜中AsA和可溶性糖含量的變化，希望為黃瓜栽培生產(chǎn)中合理使用氮肥，提高氮肥利用效率，改善果實(shí)品質(zhì)提供有價(jià)值的理論依據(jù)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)于2016年5～7月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所無土栽培課題組玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，所用材料為黃瓜“9930”（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃瓜育種課題組提供）。2016年5月21日選取飽滿的黃瓜種子進(jìn)行催芽，50℃溫水浸泡30 min，5%次氯酸鈉溶液遮光浸泡15 min，清水清洗3次后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育約24 h，種子露白后在穴盤中進(jìn)行育苗。黃瓜植株長(zhǎng)至一葉一心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移植到29 cm×12.5 cm×7.5 cm的長(zhǎng)方體水培槽中，每個(gè)水培槽中定植兩株黃瓜植株。其中營(yíng)養(yǎng)液為改進(jìn)的hoagland營(yíng)養(yǎng)液，其中各營(yíng)養(yǎng)元素組分及濃度如下：Ca2+4 mmol/L，NH+41 mmol/L，K+6 mmol/L，PO43-1 μmol/L，SO42-3.5 μ mol/L，Mg2+2 mmol/L，F(xiàn)e3+79.01 μ mol/L，Mo6+0.11 μmol/L，Cu2+0.32 μmol/L，Zn2+0.77 μmol/L，Mn2+9.59 μ mol/L，B3+46.26 μ mol/L。配制營(yíng)養(yǎng)液所需水均為蒸餾水，并調(diào)整營(yíng)養(yǎng)液pH值為5.8～6.0，水培期間采用電動(dòng)通氣泵裝置為植株進(jìn)行間歇供氧。

試驗(yàn)共分為3個(gè)處理，各處理的氮素供應(yīng)濃度分別為 CK，12 mmol/L；T1，0 mmol/L；T2，3 mmol/L。除氮素濃度不一樣外，其他營(yíng)養(yǎng)元素含量一致。在黃瓜植株雌花開放當(dāng)天進(jìn)行短期（7 d）不同營(yíng)養(yǎng)液處理，并將雌花開花當(dāng)天記為0 d，分別在處理的0、1、3、5、7 d對(duì)黃瓜植株的葉片和果實(shí)進(jìn)行取樣和相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。其中，植株生長(zhǎng)期間，每隔3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，處理之前將植株底部節(jié)位的根瓜摘除，取樣果實(shí)及葉片統(tǒng)一保持在第5～8節(jié)位之間，其他栽培管理技術(shù)同日常生產(chǎn)管理一致。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 黃瓜AsA的提取及測(cè)定

分別在處理的0、1、3、5、7 d取各處理植株葉片和果實(shí)，并用錫紙包裹后迅速置于液氮中，保存在超低溫冰箱中，用于AsA含量測(cè)定，其中AsA相關(guān)提取和測(cè)定方法參考Kampfenkel等［7］的方法，稍加改進(jìn)。

AsA和總量抗壞血酸（T-AsA，包括抗壞血酸氧化型AsA和還原型DHA）的提?。簻?zhǔn)確稱取葉片樣品0.3～0.6 g，果實(shí)樣品1.0～3.0 g，加入6%（w/v）的預(yù)冷TCA溶液（含1 mmol/L的EDTA），在冰上研磨至勻漿，后定容至5 mL，于4℃下11 000 r/min離心20 min，收集上清液用于AsA和T-AsA 含量測(cè)定。

T-AsA含量測(cè)定反應(yīng)體系：首先在離心管中加入0.8 mL 0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH值7.4）和0.2 mL待測(cè)樣品上清液，然后依次加入0.2 mL 6 mmol/L的二硫蘇糖醇溶液（DTT，用0.2 mol/L的磷酸緩沖液配制，并含有3%冰醋酸，現(xiàn)用現(xiàn)配），42℃溫水浴15 min，取出后加入0.1 mL 0.5% 的N-ethylmaeimide溶液（NEM，用預(yù)冷的0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液配制），室溫靜置2 min，而后分別依次加入1 mL 10%的TCA，0.8 mL 42%的磷酸，0.8 mL 2%的2，2’-雙吡啶溶液（用70%乙醇配制溶液），0.4 mL 3% FeCl3溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），充分混勻后42℃水浴60 min，短暫離心后取上清液在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，其中以0.2 mL磷酸緩沖液作為空白對(duì)照。根據(jù)T-AsA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中的T-AsA含量。

T-AsA濃度的計(jì)算公式為：A525=0.735 9×C（T-AsA）-0.027 3，R2=0.993 6。 其 中，A525代 表525 nm波長(zhǎng)處的吸光值，C（T-AsA）代表樣品中T-AsA濃度。根據(jù)待測(cè)樣品鮮重，進(jìn)一步計(jì)算樣品中T-AsA含量。

AsA含量測(cè)定反應(yīng)體系：首先在離心管中加入0.8 mL 0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH值7.4）和0.2 mL待測(cè)樣品上清液，然后依次分別加入1 mL 10%的TCA，0.8 mL 42%的磷酸，0.8 mL 2%的2，2’-雙吡啶（用70%乙醇配制溶液），0.4 mL 3%FeCl3溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），充分混勻后42℃水浴60 min，短暫離心后取上清液在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，其中以0.2 mL磷酸緩沖液作為空白對(duì)照。根據(jù)AsA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中的AsA含量。

AsA 濃度：A525=0.837 2×C（AsA）-0.021 7，R2=0.996 8。其中，A525代表525 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，C（AsA）代表樣品中AsA濃度。根據(jù)待測(cè)樣品鮮重，進(jìn)一步計(jì)算樣品中AsA含量。

DHA含量即為T-AsA與AsA含量差，并根據(jù)AsA和DHA含量計(jì)算樣品中氧化還原比率即AsA/DHA。

1.2.2 黃瓜可溶性糖的提取及測(cè)定

樣品中可溶性糖的提取：準(zhǔn)確稱取葉片樣品3～5 g，果實(shí)樣品10 g，其中果實(shí)樣品置于研缽中冰上研磨至勻漿，葉片樣品中加入與樣品質(zhì)量等比例（w∶v=1∶1）的滅菌ddH2O冰上研磨至勻漿，將勻漿樣品置于80℃熱水浴1 h，水浴后12 000 r/min離心20 min，然后收集上清液經(jīng)0.22μ m的濾膜過濾后，上樣至高效液相色譜（HPLC）用于可溶性糖組成及含量測(cè)定。

樣品可溶性糖的測(cè)定方法及其色譜條件：每個(gè)樣品進(jìn)樣體積為10 μ L，上樣至Waters 2695系列高效液相色譜儀（Waters，USA），儀器分別使用Enpower Pro工作站和Waters 2414示差折光監(jiān)測(cè)器，色譜柱為Agilent Polaris 3 NH2（250×460 mm，3μ m），柱溫為25℃，檢測(cè)池溫度為35℃，流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20（v∶v），流速保持1 mL/min。

可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品共測(cè)定7種可溶性糖（圖1），根據(jù)保留時(shí)間分別是木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖，實(shí)際樣品測(cè)定中共測(cè)出木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖4種糖，部分樣品測(cè)定出半乳糖，每個(gè)上樣樣品重復(fù)測(cè)定兩次，每個(gè)處理均有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，計(jì)算3次重復(fù)的平均值作為最后結(jié)果。

數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行，采用DUNCAN法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析，其中，*和**分別表示處理與對(duì)照之間的差異顯著性，即顯著和極顯著（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 7種可溶性糖高效液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 短期低氮處理對(duì)黃瓜AsA含量的影響

短期低氮處理下，T1和T2黃瓜果實(shí)中的T-AsA和AsA含量均高于CK，但是隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)和果實(shí)膨大發(fā)育，T-AsA、AsA、DHA含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖2）。T1果實(shí)中T-AsA含量在處理第3、5 d顯著高于CK，分別增加了16.4%和69.5%；T1和T2中 的AsA含 量 在 處 理 第1、3 d顯著增加，其中第1 d T1和T2分別增加21.2%和19.9%，第3 d T1和T2分別增加24%和19%；與CK相比，處理果實(shí)DHA含量在處理起始階段變化不大，與CK無顯著差異，但是在處理后第5 d兩處理果實(shí)中DHA含量均顯著高于CK，分別增加了112%和81.7%；此外，處理期間T1和T2果實(shí)中AsA/DHA隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在處理起始階段T1和T2的AsA/DHA略高于CK，但是隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)CK中AsA/DHA上升，可能是隨著低氮處理的持續(xù)，處理果實(shí)中AsA的氧化能力增強(qiáng)，被相關(guān)的氧化酶氧化為DHA，不能及時(shí)還原為AsA。

圖2 處理期黃瓜果實(shí)中AsA含量變化

與果實(shí)AsA含量變化不同，處理期間葉片中AsA含量保持平穩(wěn)增加（圖3），這可能是因?yàn)榻Y(jié)果期果實(shí)處于迅速膨大期和發(fā)育期，果實(shí)中水分含量增加明顯，而葉片作為光合組織不斷通過光合作用合成光合產(chǎn)物。在處理期間，處理葉片T-AsA含量均高于CK，T1在處理第5、7 d T-AsA含量顯著提高，分別增加22.4%和16.9%；而處理起始階段AsA含量則并無顯著差異，在第5 d T1葉片中AsA含量提高了20.7%，在第7 d T2葉片中AsA含量提高了10.4%。葉片中DHA含量變化與果實(shí)類似，在處理期表現(xiàn)出增多的趨勢(shì)，T1在處理第5、7 d比對(duì)照提高了24.6%和65.2%。葉片AsA/DHA變化與果實(shí)變化不同，其中T1葉片的AsA/DHA在處理期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在處理第5 d達(dá)到最大值，在處理第7 d顯著低于T2和CK，而T2的AsA/DHA變化與CK的變化相似。

圖3 處理期黃瓜葉片中AsA含量變化

2.2 短期低氮處理對(duì)黃瓜可溶性糖含量的影響

短期低氮處理后，黃瓜果實(shí)和葉片中總的可溶性糖含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，且葉片中的可溶性糖含量遠(yuǎn)高于果實(shí)。在果實(shí)和葉片中，總可溶性糖含量在處理第3 d迅速增加，分別比CK增加了1倍和27.6%，達(dá)到極顯著水平。在處理第5、7 d，果實(shí)和葉片中可溶性糖含量迅速回落，第7 d含量分別降至CK含量的50%和65%（圖 4）。

圖4 處理期黃瓜果實(shí)和葉片中可溶性糖含量變化

結(jié)果表明，黃瓜葉片和果實(shí)中最主要的可溶性糖為葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和半乳糖（圖5，圖6），其中葡萄糖和果糖是含量較多的兩種可溶性糖，是黃瓜中參與代謝和積累的主要糖，而半乳糖含量最少，甚至在黃瓜幼果期（雌花開花當(dāng)天，處理第1 d）果實(shí)中沒有檢測(cè)到半乳糖（圖5）。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)和果實(shí)膨大發(fā)育，處理果實(shí)中木糖含量明顯減少，葡萄糖和果糖在處理3 d之后含量顯著提高，果實(shí)中T1處理的葡萄糖和果糖含量均在處理第3 d達(dá)到最大值而后下降，T2與T1相比有一定滯后性，在處理第5 d含量最高。除此之外，處理果實(shí)中蔗糖含量無明顯變化，而CK果實(shí)蔗糖含量則一直增加；相反，半乳糖在處理果實(shí)中含量明顯增加，而CK果實(shí)中則無顯著積累。

圖5 處理期黃瓜果實(shí)中5種可溶性糖含量變化

黃瓜葉片中葡萄糖和果糖含量明顯高于其他可溶性糖（圖6）。處理期間葉片中木糖含量顯著降低，半乳糖、果糖和葡萄糖含量增加，在處理第3、5 d增加明顯；其中蔗糖含量變化與果實(shí)不同，果實(shí)中蔗糖含量較高，葉片中果糖含量明顯高于蔗糖，葉片在T1處理的3～5 d果糖含量增加明顯，T2中果糖含量與CK無顯著差異。

圖6 處理期黃瓜葉片中5種可溶性糖含量變化

3 討論

很多研究表明適宜濃度的氮素不僅有利于蔬菜［8］、作物［9］植株的生長(zhǎng)發(fā)育，而且對(duì)提高果實(shí)產(chǎn)量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量等品質(zhì)改善及降低硝酸鹽積累有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)氮素營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)與蔬菜作物體內(nèi)可溶性糖、淀粉等碳水化合物及蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)的合成積累有密切關(guān)聯(lián)。目前在黃瓜［4］、菠菜［1］、白菜［3］、生菜［2］等蔬菜作物中均發(fā)現(xiàn)供氮水平越高，可溶性糖越低，且在菠菜中發(fā)現(xiàn)過高和過低的氮素供應(yīng)使得其葉片中AsA含量降低［1］。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，短期低氮處理的3、5 d時(shí)處理黃瓜中T-AsA、AsA含量均高于CK；同樣在黃瓜葉片中T1處理第7 d DHA含量明顯高于T2和CK。處理黃瓜中T-AsA、AsA、DHA含量的變化說明短期低氮處理在一定程度上促進(jìn)了葉片和果實(shí)中AsA含量的增加，這可能與AsA對(duì)植物逆境脅迫的響應(yīng)有關(guān)。Shalata等［10］、Conklin等［11］、劉志禮等［12］、Zhang等［13］、孫娜等［14］研究發(fā)現(xiàn)在低鹽、臭氧、紫外線、低氮等環(huán)境脅迫下，番茄、擬南芥、黃瓜幼苗等葉片中AsA含量增加，提高了其植株對(duì)逆境脅迫的抗性。本試驗(yàn)研究中短期低氮處理的黃瓜植株可能會(huì)以外界氮素營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)水平的顯著降低（T1處理為完全氮脅迫，T2處理為低氮脅迫）作為信號(hào)來激活并調(diào)控其抗氧化物質(zhì)（AsA），從而使黃瓜植株對(duì)低氮處理這一短期養(yǎng)分脅迫作出響應(yīng)，但是隨著處理時(shí)間的持續(xù)，在后期T2處理葉片和果實(shí)中AsA/DHA提高，這說明在處理后期AsA的還原再生速率高于其氧化速率，促進(jìn)了DHA的還原和AsA再生積累，因此維持了T-AsA含量的穩(wěn)定甚至增多。

可溶性糖是綠色植物光合作用的重要產(chǎn)物，能夠參與植物體內(nèi)諸多重要的代謝過程。在瓜果類蔬菜中，可溶性糖是果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其組成和含量不僅影響了果實(shí)的風(fēng)味和品質(zhì)，而且可以作為上游底物和原料參加下游物質(zhì)代謝與合成，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育［15］。黃瓜果實(shí)中主要以水蘇糖和棉子糖作為轉(zhuǎn)運(yùn)的光合產(chǎn)物，但是最終進(jìn)入果實(shí)并參與代謝過程的是葡萄糖、果糖和蔗糖。吳樹玲［15］研究發(fā)現(xiàn)在黃瓜果實(shí)中主要是葡萄糖和果糖的積累，含量比蔗糖要高，沒有檢測(cè)到棉子糖和水蘇糖。在本試驗(yàn)中，通過高效液相色譜法（HPLC）在黃瓜葉片和果實(shí)中共檢測(cè)到葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、半乳糖5種可溶性糖，其中含量較高的是葡萄糖和果糖，在CK植株中木糖含量也較高，而半乳糖含量最低，但在發(fā)育初期的幼嫩果實(shí)中沒有檢測(cè)到半乳糖，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似［16］。此外，由植物AsA合成途徑可知，AsA合成的最上游底物是葡萄糖，而氮素供應(yīng)水平可直接影響植物光合產(chǎn)物積累和碳氮代謝。已有研究表明，糖代謝為植物中的很多抗氧化物質(zhì)合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和原料，其中葡萄糖供給使植物氧化還原能力增強(qiáng)，提高了植物抗性［17］。Smirnoff等［18］研究發(fā)現(xiàn)外源葡萄糖供給可以保持暗處理下植物葉片中AsA含量，Nishikawa等［19］研究結(jié)果表明外源蔗糖供給可以延緩采后花椰菜中AsA含量的損失，AsA含量增加；Loreti等［20］、Blokhina等［21］發(fā)現(xiàn)在缺氧脅迫下，外源糖供給能提高擬南芥幼苗對(duì)氧化脅迫的抗性，對(duì)植物起到保護(hù)作用。這些研究表明，可溶性糖不僅僅是植物碳水化合物的供給，同時(shí)也在植物遭受逆境脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)短期低氮處理黃瓜中葡萄糖、果糖、半乳糖含量提高，同時(shí)AsA含量增加?？扇苄蕴鞘茿sA合成的重要原料和中間底物，由此可知，處理黃瓜中糖含量的積累給下游AsA合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，因此黃瓜果實(shí)和葉片中可溶性糖含量和AsA含量均有所增加，這對(duì)通過有效使用氮肥來改善黃瓜果實(shí)的部分品質(zhì)指標(biāo)有一定的指導(dǎo)意義。