戴春威， 賈 珊， 陳 敏， 樊 琳， 何賽飛

(1慶陽市人民醫(yī)院兒科， 甘肅 慶陽 745000; 2上海市中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院核醫(yī)學科， 上海 200137)

肺泡上皮細胞是肺組織損傷發(fā)生時的靶細胞之一，其中肺泡Ⅱ型上皮細胞過度凋亡是肺損傷發(fā)生的重要原因[1]。內(nèi)毒素是引起肺損傷發(fā)生的誘導因子，而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，由LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡也是目前研究肺損傷發(fā)生機制的常見模型[2]。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，微小RNA(microRNA,miRNA)在肺泡上皮細胞損傷中的作用受到廣泛關注，肺泡上皮細胞中某些miRNA異常表達導致細胞特性異常，從而誘發(fā)肺組織功能缺失[3]。由于原代肺泡Ⅱ型上皮細胞對于微環(huán)境等要求極高，目前常用肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的A549細胞作為研究對象[4]。miR-486是一個與細胞凋亡關系密切的miRNA分子，其在氧化應激條件下的肺泡上皮細胞中發(fā)揮保護作用，具有抗細胞凋亡的作用[5]。現(xiàn)階段對于miR-486在LPS誘導的肺泡上皮細胞中的作用尚不清楚。本次實驗以肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的A549細胞作為體外實驗對象，探討miR-486在LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡中的作用和機制。

材 料 和 方 法

1 材料

肺泡Ⅱ型上皮細胞A549購自ATCC。LPS購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；miR-486 mimics、mimics control、pcDNA 3.1-PTEN和pcDNA 3.1均由上海吉瑪制藥技術有限公司構(gòu)建并合成；抗第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)抗體購自Abcam；抗cleaved caspase-3(C-caspase-3)抗體和C-caspase-9抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；MicroRNA Reverse Transcription Kit購自QIAGEN；螢光素酶報告載體由湖南普拉特澤生物科技有限公司構(gòu)建。

2 方法

2.1RT-qPCR檢測LPS誘導后肺泡上皮細胞中miR-486表達變化 肺泡上皮細胞用含150 mg/L LPS[2]的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),記為LPS組，用不含LPS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為對照(control)組，細胞培養(yǎng)24 h以后，用RT-qPCR檢測細胞中miR-486的表達變化。RT-qPCR步驟為：利用TRIzol分別提取細胞中的總RNA，依照MicroRNA Reverse Transcription Kit進行反轉(zhuǎn)錄，利用SYBR Premix Ex Taq進行RT-qPCR，U6為內(nèi)參照，反應結(jié)束以后根據(jù)每個反應的Ct值按照2-△△Ct方法分析miR-486表達變化。miR-486的上游引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGACCTGCCC-3’，下游引物序列為5’-CTCAACTGGTCTCGTGGA-3’；U6的上游引物序列為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。PCR儀參數(shù)為：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，共40個循環(huán)。

2.2細胞轉(zhuǎn)染 用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別把miR-486 mimics和mimics control轉(zhuǎn)染到肺泡上皮細胞中，轉(zhuǎn)染步驟完全按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行。細胞轉(zhuǎn)染后，用含有150 mg/L LPS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記為miR-486+LPS組和miR-NC+LPS組，按照方法2.1中RT-qPCR方法測定細胞中miR-486的表達變化。

2.3流式細胞術測定細胞凋亡 取培養(yǎng)24 h以后的各組細胞，PBS洗滌后每組每個樣品收集約1×106個細胞，把細胞懸浮在500 μL的Binding Buffer溶液中，繼續(xù)添加5 μL的PI及Annexin V-FITC，孵育完畢立即用流式細胞儀測定各組細胞凋亡變化。

2.4Western blot檢測細胞中C-caspase-3和C-caspase-9蛋白表達水平 在培養(yǎng)24 h以后的各組細胞中分別加入添加PMSF的RIPA蛋白提取試劑，均勻振混合以后，在冰上完全裂解，把裂解溶液轉(zhuǎn)移到4℃中高速離心(12 000×g，離心10 min)，得到的上清溶液轉(zhuǎn)移到EP管內(nèi)，采用BCA法定量檢測以后，進行SDS-PAGE。在電泳前將蛋白樣品同上樣緩沖液混合煮沸5 min，每個上樣孔內(nèi)添加30 μg蛋白樣品。使用10%的分離膠進行電泳，采用恒壓90 V電泳約3 h，觀察染料進入到底部邊緣以后終止電泳。轉(zhuǎn)膜電流為250 mA恒流，轉(zhuǎn)膜持續(xù)60 min。轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放在提前配制的5%牛血清白蛋白封閉液中室溫孵育1.5 h，再分別與I抗(4 ℃反應過夜)、II抗(37 ℃反應1 h)依次反應以后，按照常規(guī)ECL方法顯色，用Image J軟件分析條帶的灰度值，β-actin作為內(nèi)參照，對蛋白水平進行分析比較。

2.5靶基因預測及螢光素酶報告系統(tǒng)鑒定 利用靶基因預測軟件預測PTEN可能是miR-486的靶基因，miR-486與PTEN的3，UTR端有互補結(jié)合位點，把PTEN的互補結(jié)合位點突變，構(gòu)建突變型(MUT)螢光素酶報告載體，同時構(gòu)建沒有突變的野生型(WT)螢光素酶報告載體，用Lipofectamine 2000分別將WT、MUT與miR-486 mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染至細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，利用螢光素酶活性測定試劑盒檢測螢光素酶活性變化。

2.6上調(diào)PTEN后，觀察miR-486 mimics對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響 用Lipofectamine 2000分別將miR-486 mimics和pcDNA 3.1-PTEN、miR-486 mimics和pcDNA 3.1共轉(zhuǎn)染至肺泡上皮細胞中，使用含150 mg/L LPS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為miR-486+pcDNA3.1+LPS組和miR-486+PTEN+LPS組。流式細胞術測定細胞凋亡變化，Western blot檢測細胞中PTEN、C-caspase-3和C-caspase-9蛋白表達變化，步驟均同上。

3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-486 mimics上調(diào)LPS誘導的肺泡上皮細胞中miR-486的表達水平

肺泡上皮細胞經(jīng)過LPS處理以后，細胞中的miR-486水平顯著降低(P<0.05)，說明LPS誘導肺泡上皮細胞中miR-486表達下調(diào)；肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)染miR-486 mimics后，LPS刺激的細胞中miR-486的表達水平顯著升高(P<0.05)，說明miR-486 mimics可以顯著上調(diào)LPS誘導的肺泡上皮細胞中miR-486的表達水平，見表1。

表1 miR-486 mimics上調(diào)LPS誘導的肺泡上皮細胞中miR-486表達水平

Table 1. miR-486 mimics up-regulate the expression of miR-486 in LPS-induced alveolar epithelial cells (Mean±SD.n=3)

GroupmiR-486Control1.00±0.10LPS0.64±0.08?miR-NC+LPS0.63±0.05miR-486+LPS1.35±0.12#

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmiR-NC+LPS group.

2 miR-486 mimics減少LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡

肺泡上皮細胞經(jīng)過LPS刺激以后，細胞凋亡率顯著升高，細胞中C-caspase-3和C-caspase-9蛋白水平也顯著升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-486 mimics后，LPS誘導的細胞凋亡率顯著下調(diào)，并且細胞中的C-caspase-3和C-caspase-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。結(jié)果提示miR-486 mimics減少LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡。

Figure 1. Effects of miR-486 mimics transfection on apoptosis of alveolar epithelial cells after LPS treatment.A: flow cytometry was used to detect apoptotic rate in each group; B: Western blot was used to detect the expression of C-caspase-3 and C-caspase-9 in cells of each group.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol grpup;#P<0.05vsmiR-NC+LPS group.

圖1 miR-486 mimics轉(zhuǎn)染對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響

3 miR-486靶向調(diào)控PTEN的表達

靶基因預測軟件發(fā)現(xiàn)miR-486同PTEN的3’-UTR端有互補結(jié)合位點，見圖2；經(jīng)過雙螢光素酶報告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)PTEN為miR-486的靶基因，見表2。

Position 719-726 of PTEN 3’ UTR 5’...UGAAUCUGUAUUGGGGUACAGGA
hsa-miR-486 3’ GAGCCCCGUCGAGUCAUGUCCU

Figure 2. Target gene prediction software predicts that there are binding sites at the 3’UTR ends of PTEN and miR-486.

圖2 靶基因預測軟件預測miR-486與PTEN的3’UTR端有結(jié)合位點

表2 螢光素酶報告系統(tǒng)測定螢光素酶活性變化

Table 2. Luciferase activity changes determined by luciferase reporting system(Mean±SD.n=3)

GroupMUTWTmiR-NC1.00±0.071.00±0.11miR-4861.02±0.100.52±0.04?

*P<0.01vsmiR-NC group.

4 miR-486 mimics下調(diào)LPS誘導的肺泡上皮細胞中PTEN的表達

LPS處理后的肺泡上皮細胞中的PTEN蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-486 mimics后的肺泡上皮細胞中PTEN蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，見圖3，說明miR-486負調(diào)控PTEN蛋白的表達。

Figure 3. Effects of miR-486 mimics transfection on PTEN expression in LPS-treated alveolar epithelial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmiR-NC+LPS group.

圖3 miR-486 mimics轉(zhuǎn)染對LPS處理的肺泡上皮細胞中PTEN蛋白表達的影響

5 上調(diào)PTEN逆轉(zhuǎn)miR-486 mimics對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡影響

將miR-486 mimics和pcDNA 3.1-PTEN共轉(zhuǎn)染可以顯著提高LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡水平，并促進細胞中PTEN、C-caspase-3和C-caspase-9蛋白的表達，與共轉(zhuǎn)染miR-486 mimics和pcDNA 3.1的細胞比較，差異顯著(P<0.05),見圖4,說明上調(diào)PTEN可逆轉(zhuǎn)miR-486 mimics對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響。

討 論

肺泡Ⅱ型上皮細胞具有分泌活性物質(zhì)、維持肺泡氣體交換等作用，在肺組織功能維持中具有關鍵作用[6]。LPS是內(nèi)毒素的主要成分，也是肺組織中肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷發(fā)生的直接誘導因子[7]。我們的實驗以LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的A549細胞，觀察到LPS刺激可以提高細胞凋亡水平，說明成功構(gòu)建了LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷模型。

miR-486是近年發(fā)現(xiàn)在人體組織中具有一系列生物學作用的miRNA分子，與造血細胞分化和干細胞衰老等正常生理學過程有關，還與心肌纖維化和腫瘤等有關[8-11]。miR-486在氧化應激及PM2.5誘導的肺泡上皮細胞凋亡中表達下調(diào)，并且上調(diào)miR-486可以減少細胞凋亡發(fā)生，從而發(fā)揮細胞保護的作用[5]。本實驗觀察到，LPS處理后的肺泡上皮細胞中的miR-486的表達水平下降，通過細胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)miR-486后可以顯著減少LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡，這提示miR-486在肺組織損傷中可能發(fā)揮抗損傷作用。

現(xiàn)階段對于miRNA的研究表明，其可以通過靶向調(diào)控靶基因的表達發(fā)揮各種生物學作用，并且同一個miR-486可能同時含有多個靶基因[12]。研究者們發(fā)現(xiàn)miR-486有GAB2、CLDN10、CITRON和Sirt1等多個靶基因，參與不同組織細胞的病理及生理過程[13-15]。本實驗檢測miR-486與PTEN有靶向結(jié)合互補位點，經(jīng)過雙螢光素酶系統(tǒng)鑒定PTEN為miR-486的靶基因。PTEN是一個與細胞凋亡有關的凋亡促進因子，其可以激活細胞中caspase級聯(lián)反應誘導凋亡，在心肌缺血損傷、缺氧神經(jīng)元損傷和脊柱損傷等過程中發(fā)揮保護作用[16-18]。caspase-3和caspase-9是caspase蛋白家族成員，只有被活化后形成C-caspase-3和C-caspase-9才可以誘導細胞凋亡的發(fā)生[19-21]。本研究顯示，過表達miR-486可以降低肺泡上皮細胞中PTEN的表達，并且PTEN上調(diào)可以逆轉(zhuǎn)miR-486 mimics對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡及C-caspase-3、C-caspase-9表達的抑制作用，這提示miR-486可能通過靶向負調(diào)控PTEN的表達影響caspase級聯(lián)反應從而減少LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡發(fā)生。

Figure 4. Effects of co-transfection of miR-486 mimics and pcDNA 3.1-PTEN on LPS-induced apoptosis of alveolar epithelial cells.A:the apoptotic rate of alveolar epithelial cells were detected by flow cytometry;B:Western blot was used to detect the expression of PTEN, C-caspase-3 and C-caspase-9 in alveolar epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-486+pcDNA 3.1+LPS group.

圖4 miR-486 mimics和pcDNA 3.1-PTEN共轉(zhuǎn)染對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響

本次實驗沒有探討PTEN通過何種靶向關系調(diào)控細胞凋亡，對于miR-486在原代肺泡Ⅱ型上皮細胞中的作用還不明確，在以后的實驗中會進行具體的探討。本次實驗證實了miR-486在LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡中的作用，并且對于其機制進行了初步探討，這對于研究miR-486在肺組織損傷中的調(diào)控網(wǎng)絡具有參考價值。