亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        p53轉(zhuǎn)錄激活的miR-192在小鼠急性肝損傷發(fā)病過程中的表達(dá)變化*

        2019-10-24 11:17:16雅,鳴,
        中國病理生理雜志 2019年10期
        關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞引物肝臟

        楊 雅, 王 鳴, 艾 國

        (華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院 1感染科, 2兒科, 湖北 武漢 430030)

        急性肝損傷(acute liver injury,ALI)是臨床上常見的一種疾病,病情發(fā)展迅速、兇險,臨床典型特征表現(xiàn)為肝功能衰竭,肝組織中大量肝細(xì)胞壞死和凋亡[1],若未得到及時的診斷和治療,將會發(fā)展為病死率非常高的重癥肝炎和肝功能衰竭等不可逆性疾病。導(dǎo)致急性肝損傷的因素包括肝炎病毒、化學(xué)性毒物或藥物、酒精及放射性刺激因素等。雖然已有較多研究探討了其致病機制,但目前尚未完全清楚。作為一種應(yīng)激蛋白,腫瘤抑制因子p53在組織細(xì)胞受損時會出現(xiàn)反應(yīng)性升高,轉(zhuǎn)錄激活下游mRNA引起細(xì)胞周期停滯及凋亡等,然而有研究表明p53的表達(dá)增加對受損細(xì)胞還能起到保護(hù)作用[2-3],但尚未明確p53的這種作用是如何實現(xiàn)的。除了通過對下游mRNA的調(diào)控來發(fā)揮相應(yīng)功能,轉(zhuǎn)錄因子p53還能轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游的微小RNA(microRNA,miRNA,miR)的表達(dá),從而在轉(zhuǎn)錄后水平行使其功能[4-5]。近年來,microRNA在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用已受到越來越多的關(guān)注,其中microRNA-192(miR-192)由p53蛋白轉(zhuǎn)錄激活[6],并在肝組織中表達(dá)豐度高,具有一定的組織特異性,但它在急性肝損傷中的作用及機制目前尚并不明確。因此,本實驗通過建立細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)聯(lián)合D-氨基半乳糖(D-galactose,D-GalN)誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素性急性肝損傷模型,以期發(fā)現(xiàn)p53轉(zhuǎn)錄激活的miR-192在肝損傷中的表達(dá)變化,以及p53、p21和miR-192在肝損傷過程中的對應(yīng)關(guān)系。

        材 料 和 方 法

        1 動物和主要試劑

        SPF 級雄性BALB/c小鼠24只,6~8 周齡,體重 18~22 g,購自湖北省實驗動物研究中心,許可證編號為SYXK(鄂2014-0049)。實驗前1 d領(lǐng)取動物,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。D-GalN和 LPS均購自Sigma-Aldrich;TRIzol試劑購自Invitrogen;PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、TaqDNA聚合酶和SYBR GreenⅠ熒光染料購自TaKaRa;小鼠引物由北京擎科生物有限公司合成;miR-192及U6的引物由廣州銳博生物合成;Western blot 相關(guān)抗體購自Abcam。

        2 主要方法

        2.1急性肝衰竭小鼠模型的建立 將小鼠隨機分為對照(0 h)組及3個不同處理時間的模型(1 h、3 h和6 h)組,共4組,每組 6只。模型組給予D-GalN(每只20 mg)和 LPS(每只0.5 mg)混合后腹腔注射,對照組注射同等劑量的生理鹽水。具體過程如下:對照組和6 h組分別給予生理鹽水和藥物腹腔注射,對于3 h和1 h組小鼠,分別間隔3 h和5 h后注射藥物;最后同時摘掉此24只小鼠眼球取血并頸椎脫臼處死,解剖小鼠、取出肝臟。取部分肝組織固定于4%多聚甲醛溶液中,用于石蠟包埋及HE 染色;剩余部分凍存在-80 ℃冰箱中,用于組織mRNA和蛋白的提取。本實驗已通過本院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

        2.2小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino-transferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平的檢測 各組小鼠經(jīng)乙醚麻醉后摘取眼球采集外周血,離心后收集血清送本院檢驗科檢測生化指標(biāo)。

        2.3肝組織病理學(xué)觀察 肝臟用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋、切片,然后行HE染色,顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

        2.4小鼠肝組織miR-192、p53 mRNA和p21 mRNA水平的檢測 (1) RNA提取:取肝組織約50 mg加入TRIzol 1 mL, 剪碎并用超聲裂解儀充分裂解后,加入氯仿 0.2 mL,劇烈振蕩15 s后靜置5 min,4 ℃、12 000×g離心 15 min。取上層液,轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中,加入等體積異丙醇,上下顛倒充分混勻后,室溫靜置10 min,4 ℃、12 000×g離心10 min;小心棄去上清, 加入75%乙醇 1 mL,上下顛倒、洗滌管壁,4 ℃、7 500×g離心 5 min 后,棄去上清;打開離心管蓋,室溫干燥沉淀。待沉淀干燥后,加入適量的無酶水溶解沉淀。置于-80 ℃冰箱凍存。(2)RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA:按 PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書配制RT 反應(yīng)液,反應(yīng)液體系為 20 μL, 輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),條件:37℃,15 min;85 ℃,5 s。(3)實時熒光定量PCR:PCR的反應(yīng)體系為 10 μL, 其中上、下游引物各0.5 μL,cDNA 3 μL,DEPC 水 1 μL,SYBR Green 5 μL。PCR 儀型號為StepOne Plus Real-Time PCR System。GAPDH的上游引物序列為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物序列為5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’;p53的上游引物序列為5’-CCCCTGTCATCTTTTGTCCCT-3’,下游引物序列為5’-AGCTGGCAGAATAGCTTATTGAG-3’;p21的上游引物序列為5’-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3’,下游引物序列為5’-CCATGAGCGCATCGCAATC-3’; miR-192的上游引物序列為5’-ACTCTGGCCCCCTATTGTCT-3’,下游引物序列為5’-CACCCTTGTGTCCTTTGGTT-3’;U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR擴增程序:熱激活,95 ℃ 30 s;變性,95 ℃ 5 s,退火及延伸60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。miR-192及U6的引物由廣州銳博生物提供,miRNA的反轉(zhuǎn)錄及PCR操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        2.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 用RIPA提取組織總蛋白,并用 BCA 法測定蛋白濃度, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,按每孔30 μg計算上樣量。濃縮膠以恒壓80 V電泳,待蛋白預(yù)染標(biāo)記物完全分開后,120 V繼續(xù)電泳分離膠; 充分分離后,恒流250 mA電轉(zhuǎn)至PVDF膜上;膜在室溫下用 5%的脫脂牛奶在搖床上封閉1 h,再孵育I抗(GAPDH、p53和p21抗體均以 1 ∶1 000比例稀釋),置于4 ℃過夜; 次日將膜放入 TBST中洗3遍,每次5 min,然后室溫孵育II抗(1 ∶3 000)1 h,之后再將膜用 TBST 洗 3 次;最后曝光顯影。

        3 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用雙側(cè)t檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。GraphPad prism 5.0作統(tǒng)計繪圖。

        結(jié) 果

        1 小鼠肝臟組織病理變化的觀察

        模型組在給藥1 h后,肝組織示輕度炎癥反應(yīng);3 h后炎癥明顯加重,可見大量炎性細(xì)胞浸潤,部分肝細(xì)胞壞死;6 h后肝小葉結(jié)構(gòu)消失,大量肝細(xì)胞壞死,見圖1。

        Figure 1. The pathological changes of liver tissues in the mice at different time points after injection (HE staining, ×200).

        圖1 各組小鼠肝組織的病理學(xué)變化

        2 小鼠血漿 ALT 和 AST 水平的變化

        模型組小鼠在給藥1 h后,ALT和AST無明顯變化;3 h后其血漿中水平出現(xiàn)明顯增加; 6 h后,血漿ALT和AST水平進(jìn)一步增加(P<0.01),見圖2。從以上肝組織學(xué)檢查和血漿 ALT 和 AST 水平變化證實造模成功。

        3 肝組織miR-192相對表達(dá)水平的變化

        RT-qPCR檢測肝組織miR-192的表達(dá),在反應(yīng)體系中miR-192都能有效擴增。小鼠肝組織miR-192在給藥1 h后表達(dá)明顯增加,隨后的3 h和6 h出現(xiàn)了進(jìn)行性下調(diào)。對比ALT和AST水平發(fā)現(xiàn),miR-192在反映肝細(xì)胞損傷方面更加敏感,見圖3。

        4 肝損傷小鼠肝組織中p53和p21的mRNA及蛋白表達(dá)

        在給藥1 h后,作為應(yīng)激蛋白p53的mRNA表達(dá)出現(xiàn)反應(yīng)性升高,在3 h及6 h后又出現(xiàn)了下降;p21的mRNA表達(dá)出現(xiàn)更為明顯的改變,見圖4A。如圖4B所示,p53蛋白在給藥1 h后較對照組明顯增高,結(jié)合mRNA的結(jié)果(p53的mRNA升高不明顯)推測這種情況主要是應(yīng)激后p53蛋白的降解減少造成的,在此之后p53蛋白量再次降低;p21作為調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白,給藥1 h后,p21蛋白無明顯改變,然而隨后出現(xiàn)了上升,這與mRNA的結(jié)果并不一致,可能是由于存在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。

        Figure 2. The change of plasma ALT (A) and AST (B) levels of the mice at different time points. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 h group.

        圖2 不同時點各組小鼠血漿ALT和AST的變化

        Figure 3. The expression of miR-192 in the mouse liver tissues at different time points. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 h group.

        圖3 各組小鼠肝組織miR-192相對表達(dá)量的變化

        討 論

        肝臟是人體最大的解毒器官, 有毒物質(zhì)(包括藥物)絕大部分在肝臟被處理后變得無毒或低毒,因此肝臟也極易受到外界因素的入侵, 導(dǎo)致肝臟損傷;然而目前對于肝細(xì)胞損傷程度的判斷尚缺乏較為敏感、特異的指標(biāo)。ALT和AST作為當(dāng)前評估肝細(xì)胞功能的常用指標(biāo),由于其自身的缺點,其變化并不能完全反映肝細(xì)胞損傷的程度。近年來,隨著對miRNA生物學(xué)功能研究的開展,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)miRNA參與正常的生理活動如細(xì)胞的增殖和分化等,其表達(dá)失調(diào)還與腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外,由于miRNA是具有20個堿基左右的單鏈RNA,這使得其在血液及其它體液中比較穩(wěn)定,不易被降解,因此它還可作為預(yù)測肝癌、結(jié)腸癌和心肌梗死等疾病的新的生物學(xué)標(biāo)志物[7-8]。miR-122與miR-192均在肝組織中豐度高,已有許多研究結(jié)果顯示miR-122的表達(dá)變化與眾多肝臟疾病密切相關(guān),如病毒性肝炎、肝細(xì)胞癌和酒精性肝炎等,并發(fā)現(xiàn)miR-122的變化可反映藥物性肝損傷的程度,可作為判斷藥物性肝損傷的生物學(xué)標(biāo)志物[9-11],相較而言,miR-192在這些方面的研究尚少;再者,miR-192的特殊性在于其受抑癌基因p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞受損傷時p53蛋白將反應(yīng)性升高,miR-192也會有相應(yīng)的改變,那么miR-192只是單純增高并不發(fā)揮某些功能嗎?在急性腎損傷時已有研究發(fā)現(xiàn)腎組織p53蛋白表達(dá)增加并可能參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12],而在急性肝損傷時p53及miR-192的表達(dá)和作用仍不明確。

        我們用D-GalN和 LPS建立急性肝損傷模型,觀察在不同時點下肝臟損傷情況以及對應(yīng)肝組織miR-192的表達(dá)情況,初步探討了肝組織中miR-192和肝損傷之間的關(guān)系。由于所采集的小鼠血樣只夠用于ALT和AST的生化檢測,本實驗并未檢測血清中miR-192的變化,但仍然能夠為以后研究肝損傷血清中miR-192的變化奠定一定的基礎(chǔ)。我們的研究結(jié)果顯示,在肝損傷過程中伴隨著miR-192表達(dá)水平的變化。正常小鼠肝臟內(nèi)miR-192含量豐富,D-GalN/LPS給藥1 h后miR-192即出現(xiàn)了明顯的表達(dá)上調(diào),可能為藥物刺激后的一個反應(yīng)性變化,這與p53蛋白的變化一致;之后其表達(dá)進(jìn)行性下調(diào),推測可能為miR-192由受損肝細(xì)胞釋放到外周血中;而ALT和AST于給藥1 h后無明顯變化,說明ALT和AST的變化并不能及時反映肝細(xì)胞損傷。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)p53的表達(dá)增加對受損細(xì)胞還能起到保護(hù)作用,當(dāng)細(xì)胞損傷出現(xiàn)時,p53會激活下游基因p21的轉(zhuǎn)錄從而使細(xì)胞周期出現(xiàn)停滯,以便于損傷修復(fù);一旦損傷不可修復(fù)時便會通過對凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這種保護(hù)作用可能是通過p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游mRNA來實現(xiàn)的,結(jié)合本實驗結(jié)果,推測p53轉(zhuǎn)錄激活的miR-192和其它miRNA可能參與其中。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激引起的肝損傷中,miR-192下調(diào)能夠起到肝臟保護(hù)作用[13]。然而p53在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時表達(dá)升高,同時受p53轉(zhuǎn)錄激活的miR-192的表達(dá)也會相應(yīng)上調(diào),究竟miR-192扮演何種角色有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

        Figure 4. The expression of p53 and p21 at mRNA (A) and protein (B) levels. Mean±SD.n= 6.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

        圖4 各組小鼠肝組織p53及p21的mRNA和蛋白的表達(dá)

        綜上所述,miR-192的表達(dá)水平不僅可以作為肝損傷的標(biāo)志物,隨著相關(guān)研究的深入,越來越多的miR-192下游靶基因?qū)话l(fā)現(xiàn),miR-192在肝臟損傷時“主動”發(fā)揮的功能會得到更多的驗證。

        猜你喜歡
        肝細(xì)胞引物肝臟
        DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
        七種行為傷肝臟
        中老年保健(2022年4期)2022-11-25 14:45:02
        高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
        肝臟里的膽管癌
        肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:49:00
        外泌體miRNA在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展
        SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
        肝臟減負(fù)在于春
        IL-17A促進(jìn)肝部分切除后IL-6表達(dá)和肝臟再生
        火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
        肝細(xì)胞程序性壞死的研究進(jìn)展
        国产亚洲91精品色在线| 国产AV国片精品有毛| 精品国产福利一区二区三区| 天堂一区二区三区精品| 99久久精品免费看国产| 98久9在线 | 免费| 亚洲综合网站精品一区二区| 亚洲综合精品一区二区| 日本丰满少妇裸体自慰| 国产欧美亚洲精品a| 99久久99久久精品免观看| 免费观看日本一区二区三区| 三个男吃我奶头一边一个视频| 亚洲av无码国产剧情| 无码人妻丝袜在线视频| 国产区一区二区三区性色| 久久亚洲色一区二区三区| 亚洲av无码乱码国产精品fc2 | 久久国产av在线观看| 日韩美女av一区二区| 成人午夜特黄aaaaa片男男| 亚洲AV成人无码久久精品老人 | 森中文字幕一区二区三区免费| 人妻少妇精品无码专区动漫| 国产午夜亚洲精品理论片不卡| 精品国产麻豆免费人成网站| 丝袜人妻一区二区三区| 色欲av亚洲一区无码少妇| 国产丝袜精品丝袜一区二区| 中文字幕亚洲精品在线免费| 岳毛多又紧做起爽| av无码国产在线看免费网站| 欧美疯狂做受xxxxx高潮| 精品国产自拍在线视频| h视频在线播放观看视频| 久精品国产欧美亚洲色aⅴ大片| 免费看一级a女人自慰免费| 亚洲桃色蜜桃av影院| 精品国产青草久久久久福利| jizz国产精品免费麻豆| 亚洲黑寡妇黄色一级片|