賈 敏， 樊文花， 秦巧紅， 張 寒， 陳玉龍△

(西安醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所， 2藥學(xué)院生藥教研室， 陜西 西安 710021)

目前，常用的慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 動物模型大多是將實驗動物暴露于香煙煙霧[1]或直接給予蛋白水解酶[2]和炎癥刺激物(如脂多糖)[3-6]等來誘導(dǎo)產(chǎn)生，但不論哪種造模方法均或多或少具有成模時間長、操作復(fù)雜、對動物造成創(chuàng)傷或成模不穩(wěn)定等缺點[7-14]。研究表明，香煙煙霧通過鼻腔直接吸入吸煙者肺中[15]，可引起氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥病變[16]，破壞肺彈力纖維，導(dǎo)致肺通氣功能下降[17]，從而導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病。因此本研究擬采用香煙塵霧顆粒(cigarette dust particles, DSP)通過滴鼻途徑建立小鼠COPD肺功能損傷模型，并對造模的效果進(jìn)行評價，以期為研究COPD發(fā)病機制選擇更為簡便穩(wěn)定的動物模型。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠60只，8周齡，體重18～22 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SYXK(陜)2016-004。在基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)，自由飲水，飼以普通動物飼料，室溫控制在19～26 ℃，濕度控制在40%～70%，換氣次數(shù)控制在每小時10～20次，氣流控制在0.13～0.18 m/s，12 h光照/黑暗交替，噪音小于60分貝，本動物實驗步驟經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑

戊巴比妥鈉購自Merck；乙酰甲膽堿(methacholine, Mach)和脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)均購自Sigma；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1香煙煙霧顆粒溶液制備 本方法參考美國肯塔基大學(xué)的煙霧提取法[18]，取3支萬寶路牌香煙(含焦油12 mg、煙堿0.9 mg和煙氣一氧化碳12 mg)，除去濾嘴，用裝有1 mL的二甲基亞砜或蒸餾水的水煙斗收集煙霧，用真空吸塵器接水煙斗，水煙斗接口用無菌的棉花濾過。最終取得香煙煙霧顆粒溶液(即DSP)，無菌條件下吸取上述方法制備的DSP 3 μL于2 mL離心管中，加1 mL無菌生理鹽水，渦旋振蕩儀混勻，配制成3 mL/L溶液，后根據(jù)實驗需要稀釋，臨用臨配。

3.2DSP誘導(dǎo)小鼠慢性肺功能損傷模型 BALB/c雄性小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗，隨機分為5組:(1)生理鹽水對照(control, control)組；(2)LPS 100 mg/L組；(3)DSP 0.75 mL/L；(4)DSP 1.5 mL/L組；(5)DSP 3 mL/L組，每組12只。乙醚短時麻醉后，每天分別滴鼻給予上述各組溶液，每只20 μL，連續(xù)30 d。

3.3FlexiVent肺功能檢測法 各組小鼠按100 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，待其達(dá)深度麻醉自主呼吸消失后，進(jìn)行氣管插管，將插管與FlexiVent肺功能檢測儀相連，在含氧21%、呼吸頻率150次/分、潮氣量10 mL、呼吸末正壓力2 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)狀態(tài)下進(jìn)行機械通氣，待呼吸平穩(wěn)后，霧化給予乙酰甲膽堿(濃度依次遞增：0、1.5、3、6、12、25、50和100 g/L)間隔時間為2 min，霧化時間為20 s，誘發(fā)小鼠支氣管平滑肌痙攣。同時檢測氣道阻力(Rrs)、氣道彈性阻力(Ers)、動態(tài)順應(yīng)性(Crs)、主氣道阻力(P-3/8Rn)、組織衰減(P-3/8G)、組織彈性(P-3/8H)、準(zhǔn)靜態(tài)彈性(Est)和準(zhǔn)靜態(tài)順應(yīng)性(Cst)。

3.4Myograph氣管環(huán)張力檢測法 取上述造模方法處理的BALB/c小鼠，處死后分別取出氣管和肺組織置于4 ℃預(yù)冷的PSS緩沖液(NaCl 119 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO4·2H2O 1.2 mmol/L，MgCl·6H2O 1.2 mmol/L，NaHCO31.5 mmol/L，Glu 5.5 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L)中，在體視顯微鏡下，分離出主支氣管，并在右側(cè)主支氣管起始部位，以2～3個軟骨環(huán)為長度剪成氣管環(huán)備用。將分離出的各組小鼠氣管掛于恒溫37 ℃的DMT L型微血管張力測定浴槽內(nèi)，持續(xù)通O2，穩(wěn)定40 min，以0.2 mN的步進(jìn)給予預(yù)張力，直至預(yù)張力達(dá)到0.8 mN。待基線穩(wěn)定后，連續(xù)2次給予60 mmol/L K+驗證氣管環(huán)活性(氣管環(huán)收縮張力超過1.0 mN)，取收縮活性好的氣管環(huán)管開始實驗。采用累積加藥法給予Mach(10-8～10-3mol/L)，觀察Mach對氣管環(huán)收縮反應(yīng)的影響。

3.5組織學(xué)檢查 實驗結(jié)束后，取血完畢后處死小鼠，迅速打開胸腔暴露肺組織，分離右肺組織和右側(cè)主支氣管起始部位5～7個軟骨環(huán)，用4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈，右肺和氣管組織置于4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木素-尹紅(HE)染色、Masson染色和間苯二酚品紅染色。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析， Graphpad Prism 5.0進(jìn)行作圖，兩組間比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FlexiVent肺功能檢測結(jié)果

DSP(3 mL/L) 連續(xù)滴鼻30 d可引起小鼠呼吸系統(tǒng)氣道阻力(Rrs)增加，氣道彈性阻力(Ers)增加，呼吸系統(tǒng)動態(tài)順應(yīng)性(Crs)降低，準(zhǔn)靜態(tài)彈性(Est)增加，準(zhǔn)靜態(tài)順應(yīng)性(Cst)降低，主氣道阻力(P-3/8Rn)增加，組織衰減(P-3/8G)降低，組織彈性(P-3/8H)降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The lung function test results of FlexiVent. Mean±SD.n=12.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 Flexivent肺功能檢測結(jié)果

2 Myograph氣管環(huán)張力檢測法

Mach在10-8～10-3mol/L劑量范圍內(nèi)可引起各組小鼠氣管環(huán)顯著收縮，且呈濃度依賴。DSP 1.5和3 mL/L 連續(xù)滴鼻30 d可使Mach誘發(fā)的小鼠氣管平滑肌收縮曲線顯著左移，增加氣管平滑肌對Mach的敏感性，且能顯著增加Mach的最大收縮氣管平滑肌的效應(yīng)(P<0.01)；LPS 100 mg/L 連續(xù)滴鼻30 d可顯著增加Mach的最大收縮氣道的效應(yīng)(P<0.01)，但不影響氣道對Mach的敏感性，見圖2。

Figure 2. The Myograph test results. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 Myograph氣管環(huán)張力檢測結(jié)果

3 組織學(xué)檢查結(jié)果

各組小鼠右側(cè)主支氣管經(jīng)HE、Masson和間苯二酚品紅染色檢查發(fā)現(xiàn)：LPS 100 mg/L滴鼻30 d處理小鼠支氣管纖毛排列不整齊，氣道上皮下呈明顯纖維化,見圖3(紅色箭頭處)；而DSP 3 mL/L滴鼻處理組小鼠的氣道上皮下顯著纖維化，膠原蛋白在氣道基底膜下網(wǎng)狀板沉積，網(wǎng)狀板增厚，見圖3(紅色箭頭處)。

各組小鼠右肺經(jīng)HE、Masson和間苯二酚品紅染色檢查發(fā)現(xiàn)LPS 100 mg/L滴鼻30 d處理小鼠可見肺部支氣管管腔變形，炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁肌纖維增多而膠原纖維增加不明顯，見圖4(紅色箭頭處)；而DSP 3 mL/L滴鼻處理小鼠的肺部支氣管管腔嚴(yán)重變形，肺部可見大量炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁肌纖維和膠原纖維顯著增加，見圖4(紅色箭頭處)。

討 論

COPD是一種以氣流受限為特征的疾病，表現(xiàn)為氣流受限不完全可逆性，并呈進(jìn)行性變化，同時伴有主氣道、肺及支氣管對有害物質(zhì)所致的慢性炎性反應(yīng)增加。到目前為止COPD發(fā)生發(fā)展的確切原因并不清楚，一般認(rèn)為吸煙及被動吸煙等煙霧暴露是目前公認(rèn)的導(dǎo)致COPD發(fā)生的最重要危險因素。有研究表明長時間吸入香煙煙霧可引起呼吸道局部及肺實質(zhì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及活化的T淋巴積聚，同時局部炎癥因子釋放增多，引起局部的炎癥反應(yīng)增強[19]。目前常見COPD動物模型的復(fù)制是將實驗動物暴露于香煙煙霧中[20]或用蛋白水解酶[21]、炎癥刺激物(如LPS)[3]來誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些造模方法要么造模時間長(香煙暴露至少6個月)、要么產(chǎn)生有創(chuàng)損傷導(dǎo)致動物死亡率增加，成模率低。經(jīng)過總結(jié)前人的經(jīng)驗[14, 22-24]，本研究選用連續(xù)滴鼻30 d給予香煙塵霧顆粒的方式建立小鼠COPD肺功能損傷模型。

目前公認(rèn)的評價COPD模型的方法主要有2個部分組成，一是觀察肺及氣管病理組織學(xué)，二是測定肺功能。2010年在意大利召開的COPD動物模型會議指出：COPD是以肺功能下降為特征的疾病，因此評價COPD模型的公認(rèn)方法應(yīng)以肺功能測定為主，同時采用病理學(xué)方法觀察，將更有意義。FlexiVent采用強迫振蕩法，給予呼吸系統(tǒng)一定的壓力及流速刺激，觀察該系統(tǒng)的反應(yīng)，通過方程計算推導(dǎo)出呼吸系統(tǒng)的特性，一方面可檢測呼吸系統(tǒng)的阻力(Rrs)、彈性(Ers)及順應(yīng)性(Crs)，另一方面可檢測主氣道阻力(P-3/8Rn)、組織衰減(P-3/8G)和彈性(P-3/8H)，還可檢測肺的準(zhǔn)靜態(tài)順應(yīng)性(Cst)和彈性(Est)。小鼠肺功檢測結(jié)果表明：Rrs、Ers增加，Crs下降，提示呼吸系統(tǒng)彈性阻力增加，肺順應(yīng)性減小，整個呼吸系統(tǒng)受損，引起阻塞性通氣功能障礙；P-3/8Rn增加、P-3/8G和P-3/8H降低，提示氣道阻力顯著升高，氣道受損；Est增加，Cst下降，提示組織抗衡壓力的能力減弱，肺組織受損，且隨DSP滴鼻濃度的增加，損傷程度增大；病理學(xué)檢查顯示DSP一方面可導(dǎo)致膠原蛋白在氣道基底膜下網(wǎng)狀板過量沉積，使網(wǎng)狀板增厚，減少氣道黏膜皺褶，導(dǎo)致氣道阻力增加、氣道狹窄加重，另一方面小鼠肺部有大量炎細(xì)胞浸潤，支氣管管腔嚴(yán)重變形，肺泡壁肌纖維和膠原纖維顯著增加。另外，乙酰甲膽堿作為M膽堿受體激動劑，可直接作用于支氣管平滑肌，引起支氣管平滑肌收縮。本研究通過Myograph肌動描計系統(tǒng)進(jìn)行的體外實驗結(jié)果表明，DSP連續(xù)滴鼻30 d后Mach可誘發(fā)小鼠氣管環(huán)收縮增強，氣道平滑肌反應(yīng)性增高。綜上所述，香煙塵霧顆粒(DSP)滴鼻30 d的方法能夠較好地建立同人類COPD疾病特點一致的小鼠模型。

Figure 3. The HE, Masson, Resorcinol fuchsin staining of mouse tracheas.

圖3 小鼠氣管HE、Masson和間苯二酚品紅染色結(jié)果

Figure 4. The HE, Masson, Resorcinol fuchsin staining of mouse lungs.

圖4 小鼠肺組織HE、Masson和間苯二酚品紅染色結(jié)果