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        香煙塵霧顆粒經(jīng)鼻腔滴入建立小鼠COPD肺功能損傷模型*

        2019-10-24 11:17:20樊文花秦巧紅陳玉龍
        中國病理生理雜志 2019年10期
        關(guān)鍵詞:小鼠實驗

        賈 敏, 樊文花, 秦巧紅, 張 寒, 陳玉龍△

        (西安醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所, 2藥學(xué)院生藥教研室, 陜西 西安 710021)

        目前,常用的慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 動物模型大多是將實驗動物暴露于香煙煙霧[1]或直接給予蛋白水解酶[2]和炎癥刺激物(如脂多糖)[3-6]等來誘導(dǎo)產(chǎn)生,但不論哪種造模方法均或多或少具有成模時間長、操作復(fù)雜、對動物造成創(chuàng)傷或成模不穩(wěn)定等缺點[7-14]。研究表明,香煙煙霧通過鼻腔直接吸入吸煙者肺中[15],可引起氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥病變[16],破壞肺彈力纖維,導(dǎo)致肺通氣功能下降[17],從而導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病。因此本研究擬采用香煙塵霧顆粒(cigarette dust particles, DSP)通過滴鼻途徑建立小鼠COPD肺功能損傷模型,并對造模的效果進(jìn)行評價,以期為研究COPD發(fā)病機制選擇更為簡便穩(wěn)定的動物模型。

        材 料 和 方 法

        1 動物

        SPF級雄性BALB/c小鼠60只,8周齡,體重18~22 g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,許可證號為SYXK(陜)2016-004。在基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所SPF級實驗動物中心飼養(yǎng),自由飲水,飼以普通動物飼料,室溫控制在19~26 ℃,濕度控制在40%~70%,換氣次數(shù)控制在每小時10~20次,氣流控制在0.13~0.18 m/s,12 h光照/黑暗交替,噪音小于60分貝,本動物實驗步驟經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

        2 主要試劑

        戊巴比妥鈉購自Merck;乙酰甲膽堿(methacholine, Mach)和脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)均購自Sigma;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

        3 主要方法

        3.1香煙煙霧顆粒溶液制備 本方法參考美國肯塔基大學(xué)的煙霧提取法[18],取3支萬寶路牌香煙(含焦油12 mg、煙堿0.9 mg和煙氣一氧化碳12 mg),除去濾嘴,用裝有1 mL的二甲基亞砜或蒸餾水的水煙斗收集煙霧,用真空吸塵器接水煙斗,水煙斗接口用無菌的棉花濾過。最終取得香煙煙霧顆粒溶液(即DSP),無菌條件下吸取上述方法制備的DSP 3 μL于2 mL離心管中,加1 mL無菌生理鹽水,渦旋振蕩儀混勻,配制成3 mL/L溶液,后根據(jù)實驗需要稀釋,臨用臨配。

        3.2DSP誘導(dǎo)小鼠慢性肺功能損傷模型 BALB/c雄性小鼠60只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗,隨機分為5組:(1)生理鹽水對照(control, control)組;(2)LPS 100 mg/L組;(3)DSP 0.75 mL/L;(4)DSP 1.5 mL/L組;(5)DSP 3 mL/L組,每組12只。乙醚短時麻醉后,每天分別滴鼻給予上述各組溶液,每只20 μL,連續(xù)30 d。

        3.3FlexiVent肺功能檢測法 各組小鼠按100 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉,待其達(dá)深度麻醉自主呼吸消失后,進(jìn)行氣管插管,將插管與FlexiVent肺功能檢測儀相連,在含氧21%、呼吸頻率150次/分、潮氣量10 mL、呼吸末正壓力2 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)狀態(tài)下進(jìn)行機械通氣,待呼吸平穩(wěn)后,霧化給予乙酰甲膽堿(濃度依次遞增:0、1.5、3、6、12、25、50和100 g/L)間隔時間為2 min,霧化時間為20 s,誘發(fā)小鼠支氣管平滑肌痙攣。同時檢測氣道阻力(Rrs)、氣道彈性阻力(Ers)、動態(tài)順應(yīng)性(Crs)、主氣道阻力(P-3/8Rn)、組織衰減(P-3/8G)、組織彈性(P-3/8H)、準(zhǔn)靜態(tài)彈性(Est)和準(zhǔn)靜態(tài)順應(yīng)性(Cst)。

        3.4Myograph氣管環(huán)張力檢測法 取上述造模方法處理的BALB/c小鼠,處死后分別取出氣管和肺組織置于4 ℃預(yù)冷的PSS緩沖液(NaCl 119 mmol/L,KCl 4.6 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 1.2 mmol/L,MgCl·6H2O 1.2 mmol/L,NaHCO31.5 mmol/L,Glu 5.5 mmol/L,CaCl21.5 mmol/L)中,在體視顯微鏡下,分離出主支氣管,并在右側(cè)主支氣管起始部位,以2~3個軟骨環(huán)為長度剪成氣管環(huán)備用。將分離出的各組小鼠氣管掛于恒溫37 ℃的DMT L型微血管張力測定浴槽內(nèi),持續(xù)通O2,穩(wěn)定40 min,以0.2 mN的步進(jìn)給予預(yù)張力,直至預(yù)張力達(dá)到0.8 mN。待基線穩(wěn)定后,連續(xù)2次給予60 mmol/L K+驗證氣管環(huán)活性(氣管環(huán)收縮張力超過1.0 mN),取收縮活性好的氣管環(huán)管開始實驗。采用累積加藥法給予Mach(10-8~10-3mol/L),觀察Mach對氣管環(huán)收縮反應(yīng)的影響。

        3.5組織學(xué)檢查 實驗結(jié)束后,取血完畢后處死小鼠,迅速打開胸腔暴露肺組織,分離右肺組織和右側(cè)主支氣管起始部位5~7個軟骨環(huán),用4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈,右肺和氣管組織置于4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h以上,常規(guī)石蠟包埋,切片后進(jìn)行蘇木素-尹紅(HE)染色、Masson染色和間苯二酚品紅染色。

        4 統(tǒng)計學(xué)處理

        實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,運用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析, Graphpad Prism 5.0進(jìn)行作圖,兩組間比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 FlexiVent肺功能檢測結(jié)果

        DSP(3 mL/L) 連續(xù)滴鼻30 d可引起小鼠呼吸系統(tǒng)氣道阻力(Rrs)增加,氣道彈性阻力(Ers)增加,呼吸系統(tǒng)動態(tài)順應(yīng)性(Crs)降低,準(zhǔn)靜態(tài)彈性(Est)增加,準(zhǔn)靜態(tài)順應(yīng)性(Cst)降低,主氣道阻力(P-3/8Rn)增加,組織衰減(P-3/8G)降低,組織彈性(P-3/8H)降低(P<0.05),見圖1。

        Figure 1. The lung function test results of FlexiVent. Mean±SD.n=12.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

        圖1 Flexivent肺功能檢測結(jié)果

        2 Myograph氣管環(huán)張力檢測法

        Mach在10-8~10-3mol/L劑量范圍內(nèi)可引起各組小鼠氣管環(huán)顯著收縮,且呈濃度依賴。DSP 1.5和3 mL/L 連續(xù)滴鼻30 d可使Mach誘發(fā)的小鼠氣管平滑肌收縮曲線顯著左移,增加氣管平滑肌對Mach的敏感性,且能顯著增加Mach的最大收縮氣管平滑肌的效應(yīng)(P<0.01);LPS 100 mg/L 連續(xù)滴鼻30 d可顯著增加Mach的最大收縮氣道的效應(yīng)(P<0.01),但不影響氣道對Mach的敏感性,見圖2。

        Figure 2. The Myograph test results. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

        圖2 Myograph氣管環(huán)張力檢測結(jié)果

        3 組織學(xué)檢查結(jié)果

        各組小鼠右側(cè)主支氣管經(jīng)HE、Masson和間苯二酚品紅染色檢查發(fā)現(xiàn):LPS 100 mg/L滴鼻30 d處理小鼠支氣管纖毛排列不整齊,氣道上皮下呈明顯纖維化,見圖3(紅色箭頭處);而DSP 3 mL/L滴鼻處理組小鼠的氣道上皮下顯著纖維化,膠原蛋白在氣道基底膜下網(wǎng)狀板沉積,網(wǎng)狀板增厚,見圖3(紅色箭頭處)。

        各組小鼠右肺經(jīng)HE、Masson和間苯二酚品紅染色檢查發(fā)現(xiàn)LPS 100 mg/L滴鼻30 d處理小鼠可見肺部支氣管管腔變形,炎細(xì)胞浸潤,肺泡壁肌纖維增多而膠原纖維增加不明顯,見圖4(紅色箭頭處);而DSP 3 mL/L滴鼻處理小鼠的肺部支氣管管腔嚴(yán)重變形,肺部可見大量炎細(xì)胞浸潤,肺泡壁肌纖維和膠原纖維顯著增加,見圖4(紅色箭頭處)。

        討 論

        COPD是一種以氣流受限為特征的疾病,表現(xiàn)為氣流受限不完全可逆性,并呈進(jìn)行性變化,同時伴有主氣道、肺及支氣管對有害物質(zhì)所致的慢性炎性反應(yīng)增加。到目前為止COPD發(fā)生發(fā)展的確切原因并不清楚,一般認(rèn)為吸煙及被動吸煙等煙霧暴露是目前公認(rèn)的導(dǎo)致COPD發(fā)生的最重要危險因素。有研究表明長時間吸入香煙煙霧可引起呼吸道局部及肺實質(zhì)發(fā)生炎癥反應(yīng),使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及活化的T淋巴積聚,同時局部炎癥因子釋放增多,引起局部的炎癥反應(yīng)增強[19]。目前常見COPD動物模型的復(fù)制是將實驗動物暴露于香煙煙霧中[20]或用蛋白水解酶[21]、炎癥刺激物(如LPS)[3]來誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些造模方法要么造模時間長(香煙暴露至少6個月)、要么產(chǎn)生有創(chuàng)損傷導(dǎo)致動物死亡率增加,成模率低。經(jīng)過總結(jié)前人的經(jīng)驗[14, 22-24],本研究選用連續(xù)滴鼻30 d給予香煙塵霧顆粒的方式建立小鼠COPD肺功能損傷模型。

        目前公認(rèn)的評價COPD模型的方法主要有2個部分組成,一是觀察肺及氣管病理組織學(xué),二是測定肺功能。2010年在意大利召開的COPD動物模型會議指出:COPD是以肺功能下降為特征的疾病,因此評價COPD模型的公認(rèn)方法應(yīng)以肺功能測定為主,同時采用病理學(xué)方法觀察,將更有意義。FlexiVent采用強迫振蕩法,給予呼吸系統(tǒng)一定的壓力及流速刺激,觀察該系統(tǒng)的反應(yīng),通過方程計算推導(dǎo)出呼吸系統(tǒng)的特性,一方面可檢測呼吸系統(tǒng)的阻力(Rrs)、彈性(Ers)及順應(yīng)性(Crs),另一方面可檢測主氣道阻力(P-3/8Rn)、組織衰減(P-3/8G)和彈性(P-3/8H),還可檢測肺的準(zhǔn)靜態(tài)順應(yīng)性(Cst)和彈性(Est)。小鼠肺功檢測結(jié)果表明:Rrs、Ers增加,Crs下降,提示呼吸系統(tǒng)彈性阻力增加,肺順應(yīng)性減小,整個呼吸系統(tǒng)受損,引起阻塞性通氣功能障礙;P-3/8Rn增加、P-3/8G和P-3/8H降低,提示氣道阻力顯著升高,氣道受損;Est增加,Cst下降,提示組織抗衡壓力的能力減弱,肺組織受損,且隨DSP滴鼻濃度的增加,損傷程度增大;病理學(xué)檢查顯示DSP一方面可導(dǎo)致膠原蛋白在氣道基底膜下網(wǎng)狀板過量沉積,使網(wǎng)狀板增厚,減少氣道黏膜皺褶,導(dǎo)致氣道阻力增加、氣道狹窄加重,另一方面小鼠肺部有大量炎細(xì)胞浸潤,支氣管管腔嚴(yán)重變形,肺泡壁肌纖維和膠原纖維顯著增加。另外,乙酰甲膽堿作為M膽堿受體激動劑,可直接作用于支氣管平滑肌,引起支氣管平滑肌收縮。本研究通過Myograph肌動描計系統(tǒng)進(jìn)行的體外實驗結(jié)果表明,DSP連續(xù)滴鼻30 d后Mach可誘發(fā)小鼠氣管環(huán)收縮增強,氣道平滑肌反應(yīng)性增高。綜上所述,香煙塵霧顆粒(DSP)滴鼻30 d的方法能夠較好地建立同人類COPD疾病特點一致的小鼠模型。

        Figure 3. The HE, Masson, Resorcinol fuchsin staining of mouse tracheas.

        圖3 小鼠氣管HE、Masson和間苯二酚品紅染色結(jié)果

        Figure 4. The HE, Masson, Resorcinol fuchsin staining of mouse lungs.

        圖4 小鼠肺組織HE、Masson和間苯二酚品紅染色結(jié)果

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