姜艷紅， 焦揚(yáng)， 陳光意， 盛家和， 許青霞

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科(河南鄭州 450008)

細(xì)胞遺傳學(xué)改變是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)的重要的誘發(fā)因素之一，有先天因素和后天因素，先天因素相對而言較少，例如唐氏綜合征患者罹患白血病的概率較正常人高出15～20倍；而后天因素是大多數(shù)遺傳學(xué)異常的主要誘因，常見的病毒感染、化學(xué)誘導(dǎo)和電離輻射均可引起體細(xì)胞突變，而非隨機(jī)性染色體異常是AML中最常見的遺傳學(xué)異常[1]。半數(shù)以上的成人AML伴有非隨機(jī)的染色體異常，白血病細(xì)胞的生物學(xué)特征、治療及其預(yù)后都有密切的關(guān)系[2]。既往文獻(xiàn)對重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常與AML診治及預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較多，關(guān)于性染色體缺失AML實(shí)驗(yàn)室和臨床特點(diǎn)的總結(jié)鮮見，本研究對收集的我院近5年20例伴有性染色體缺失的初治原發(fā)AML患者實(shí)驗(yàn)室及臨床特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，希望為AML診治和預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2017年12月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科所有初治原發(fā)AML住院患者325例，患者均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)分析，AML診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)參照WHO[3]和張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]，其中伴性染色體缺失患者20例，包括男16例，女4例，年齡3～64歲，平均(34.6±18.5)歲，按照FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，M2型19例(90.5%)，M5型1例(0.5%)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)獲得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 抽取外周血和骨髓液制涂片，快速干燥后進(jìn)行瑞氏染色，根據(jù)需要進(jìn)行特殊細(xì)胞化學(xué)染色，包括過氧化物酶、堿性磷酸酶、特異性酯酶、非特異性酯酶及糖原染色等，進(jìn)行形態(tài)學(xué)分型。

1.2.2 免疫學(xué)分型檢查 抽取骨髓液2 mL并用肝素抗凝，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記的單克隆抗體檢測白血病細(xì)胞的表面抗原，并通過計(jì)算幼稚細(xì)胞抗原的表達(dá)比例來確定陽性細(xì)胞數(shù)；以細(xì)胞胞膜抗原表達(dá)比例≥20%，胞漿抗原表達(dá)比例≥10%為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算抗原的陽性率。

1.2.3 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 通過骨髓細(xì)胞直接法和(或)24 h培養(yǎng)法，按照常規(guī)制備染色體，正常核型至少要分析20個(gè)分裂象，異常核型至少要分析10個(gè)分裂象。核型異常描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2013)》的規(guī)定進(jìn)行[5]。

1.2.4 分子生物學(xué)檢查 通過熒光定量PCR檢測AML相關(guān)融合基因，采用二代測序方法檢測WT1、C-KIT、FLT3-ITD、FLT3-TKD等AML相關(guān)基因突變。

1.2.5 乳酸脫氫酶(LDH)及血常規(guī)檢測 治療前采集患者清晨空腹血，分離血清通過羅氏Cobas c701全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測LDH，通過SYSMEX XN2000血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢查。

1.2.6 治療 AML患者分別接受HAA(高三尖杉酯堿、阿克拉霉素、阿糖胞苷)、DA(去甲氧柔紅霉素、阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)等標(biāo)準(zhǔn)方案化療，部分患者緩解后接受自體或異基因造血干細(xì)胞移植。

1.2.7 療效評價(jià) 誘導(dǎo)化療后3～4周進(jìn)行骨髓檢查評價(jià)療效，完全緩解(CR)患者給予鞏固化療，部分緩解(PR)和原始細(xì)胞下降>50%者給予第2次誘導(dǎo)化療，2個(gè)療程后進(jìn)行療效評價(jià)。

1.2.8 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 形態(tài)學(xué)完全緩解(CR)、形態(tài)學(xué)完全緩解而血細(xì)胞計(jì)數(shù)未完全恢復(fù)(CRi)、部分緩解(PR)、治療失敗。

1.2.9 隨訪 所有入選患者隨訪至2018年12月31日，包括總生存(OS)、無復(fù)發(fā)生存(RFS)、無事件生存(EFS)，通過查閱病歷或打電話獲取。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)及基因檢測分析結(jié)果 20例患者中有4例(20%)X缺失，16例(80%)Y缺失，其中14例(70%)伴有單純的t(8;21)(q22;q22)易位，2例(10%)為伴有8和21號(hào)染色體易位的復(fù)雜核型，2例(10%)為伴有8和21號(hào)染色體易位的復(fù)雜變異核型，其余2例(10%)分別伴有t(9;22)(q34;q11)和der(13;14)(q10;q10)。融合基因檢測發(fā)現(xiàn)17例(85%)AML-ETO陽性，1例(5%) BCR-ABL陽性，1例(5%) CBFβ-MYH11。基因突變檢測發(fā)現(xiàn)有7例(35%)發(fā)生了WT1基因突變，3例(15%)伴有C-KIT基因突變，3例(15%)伴有FLT3-ITD基因突變，還有2例分別有FLT3-TKD和IKZF1基因突變，見表1。

表1 常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)及基因檢測分析結(jié)果

2.2 免疫分型結(jié)果 表達(dá)cMPO患者有13例(65%)，CD13者16例(80%)，CD33者17例(85%)，CD34者16例(80%)，CD38者14例(70%)，CD117者18例(90%)，CD123者13例(65%)，HLA-DR者16例(80%)，CD11C者4例(20%)，CD15者10例(50%)，CD64者6例(30%)，CD4者4例(20%)，CD7者2例(10%)，CD9者1例(5%)，CD19者9例(45%)，CD56者16例(80%)，其中有8例(40%)患者同時(shí)表達(dá)CD19和CD56。

2.3 臨床特征 20例患者，外周血白細(xì)胞(WBC)為(19.09±15.08)×109·L-1，血紅蛋白(Hb)為(67.60±17.24)g/L，血小板(PLT)為(41.90±31.94)×109·L-1，血清LDH含量為(1 002.45±767.99)U/L，骨髓原始細(xì)胞百分比為(55.05±20.16)%。見表2。

2.4 治療結(jié)果 20例患者均采用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療方案，誘導(dǎo)化療后3～4周進(jìn)行骨髓檢查評價(jià)療效，15例(75%)達(dá)到CR，4例(20%)達(dá)到CRi，1例(5%)達(dá)到PR，1個(gè)療程達(dá)CR的有15例(75%)，2個(gè)療程達(dá)CR的有4例(20%)。獲得CR患者有4例(20%)進(jìn)行了自體造血干細(xì)胞移植，2例(10%)進(jìn)行了異體造血干細(xì)胞移植，到隨訪結(jié)束時(shí)有6例(30%)復(fù)發(fā)，其中5例(25%)為骨髓復(fù)發(fā)，1例(10%)為髓外復(fù)發(fā)，11例(55%)死亡，9例(45%)存活，EFS為(19.25±15.32)個(gè)月，RFS為(18.74±15.31)個(gè)月，OS為(20.80±15.39)個(gè)月。6例進(jìn)行造血干細(xì)胞移植患者4例(66.67%)存活，2例(33.33%)死亡，EFS為(22.00±12.38)個(gè)月，RFS為(20.83±12.58)個(gè)月，OS為(30.00±17.02)個(gè)月。見表2。

表2 臨床特征與治療結(jié)果

3 討論

Riske等[6]的研究認(rèn)為性染色體丟失原因一為與年齡相關(guān)的老化現(xiàn)象；二為白血病克隆。Wong等[7]的研究顯示當(dāng)所有細(xì)胞均有Y染色體丟失，則統(tǒng)計(jì)學(xué)上與AML/MDS高度相關(guān)。2007年Huh等[8]對韓國868例血液病患者的骨髓細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，在5.1%的患者中檢出性染色體缺失，而在1.8%的患者中性染色體缺失是唯一的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，根據(jù)血液相關(guān)疾病的分類，頻率分布由高到低依次為MM 13%，AML 9.5%，MDS 7.0%，惡性漿細(xì)胞3.8%，CML3.6%，良性血液疾病2.2%，MPN 1.3%，ALL 0%和CLL 0%，結(jié)果還提示以性染色體缺失為唯一改變的可能是一種年齡相關(guān)R的現(xiàn)象，而性染色體缺失伴其他染色體異?？赡苁且环N克隆性異常。2015年Cantú等[9]分析了21～100歲的血液腫瘤患者的9 365個(gè)骨髓染色體核型，推斷出克隆性性染色體不是隨機(jī)發(fā)生的，而是傾向于發(fā)生在有其他異常的染色體核型里，而那些異常能夠影響與惡性血液病發(fā)生相關(guān)的的生物學(xué)過程。本研究325例初治原發(fā)AML患者中有20例(6.15%)伴有性染色體缺失，比例略低于上述文獻(xiàn)所報(bào)道，可能是地域差異導(dǎo)致，或者是本研究病例少的原因。

本研究20例伴性染色體缺失患者，以男性患者為主(80%)，女性患者少見(20%)，整體年齡分布偏小[平均年齡(34.6±18.5)歲]，60歲以上患者僅有2例，與上述Riske等[6]的研究結(jié)果相符。FAB分型以AML-M2為主(90.5%)，僅1例為AML-M5，20例患者中無一例是單純的性染色體，均伴有其它染色體異常，以伴有單純的t(8;21)(q22;q22)易位為主(70%)，并有2例患者是8號(hào)、21號(hào)染色體和3號(hào)或4號(hào)染色體產(chǎn)生的8和21號(hào)染色體易位的復(fù)雜變異核型。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10]約3%的t(8；21)(q22；q22)患者會(huì)發(fā)生復(fù)雜變異型染色體易位，除累及8號(hào)和21號(hào)染色體外，還同時(shí)累及其他1條或2條染色體。也研究認(rèn)為[2]復(fù)雜變異染色體易位，其中的2條染色體的斷裂點(diǎn)與典型t(8；21)(q22；q22)易位相同，且都可以形成AML-ETO融合基因，通過RT-PCR均可檢測到AMLI-ETO融合基因的轉(zhuǎn)錄本，不但與典型t(8；21)(q22；q22)易位患者的臨床特征和預(yù)后相似，而且均具有較高的CR和DFS。本研究中典型8號(hào)和21號(hào)染色體平衡易位的14例患者和第13例和第2例復(fù)雜變異核型均檢測出AML-ETO融合基因，與上述文獻(xiàn)相符。

從我們的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，伴性染色體缺失患者有較高的WBC(均值19.09×109·L-1)、骨髓原始細(xì)胞比例(均值55.05%)和血清LDH含量(均值1 002.45 U/L)，偏低的Hb(均值67.60 g/L)和PLT(均值41.90×109·L-1)。免疫表型以cMPO、CD13、CD33、CD34、CD38、CD117、CD123和HLA-DR為主，個(gè)別伴有CD11C、CD15、CD64、CD4、CD7和CD9；值得我們注意的CD19陽性者9例(45%)，CD56陽性者16例(80%)，其中有8例(40%)患者同時(shí)表達(dá)CD19和CD56，這與本研究病例有18例(90%)伴8號(hào)和21號(hào)染色體平衡易位是一致的，相關(guān)研究[11]表明AML中存在一定比例的跨系抗原的表達(dá)，跨系抗原的表達(dá)常常與基因突變具有相關(guān)性，且在AML1-ETO融合基因陽性的AML患者中免疫標(biāo)記CD19與CD56的表達(dá)尤其突出，高于其他類型AML，CD19與CD56對于預(yù)測AML中存在AML1-ETO融合基因有著重要意義，并且淋系抗原D19和CD56的表達(dá)不但可以提示存在AML1-ETO融合基因和t(8；21)染色體易位，而且還可提示好的預(yù)后和長期生存率。

AML的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，且定論不一，但是目前普遍認(rèn)為遺傳學(xué)異常的作用最為重要。遺傳學(xué)異通常包括染色體的易位、斷裂及丟失，基因融合和基因突變等。然而目前較為公認(rèn)的“二次打擊”學(xué)說指出，單類基因的異常并不能誘發(fā)急性白血病，急性白血病的發(fā)生通常需要兩類基因的共同作用，一類通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑影響腫瘤細(xì)胞的分化(例如PML-RARA、AML-ETO、CBFB-MYH11和MLL融合基因)，另一類則通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響腫瘤細(xì)胞的增殖(例如FLT3-ITD、JAK2、RAS和TEL-PDGFRB等基因突變)。本研究患者中最常伴有基因突變是WT1基因突變，其次是C-KIT和FLT3-ITD基因突變。Nomdedéu等[12]的研究報(bào)道WT1的高表達(dá)是不良預(yù)后的指標(biāo)，高表達(dá)患者CR、OS及DFS均較低。Paschka等[13]發(fā)現(xiàn)C-KIT突變大大增加了AML患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致緩解期縮短，OS下降。Cairoli等[14]的研究顯示FLT3-ITD突變與 AML的不良預(yù)后有關(guān)，表現(xiàn)為EFS和OS的降低以及復(fù)發(fā)率的升高。本組20例患者通過標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案化療后，1個(gè)療程達(dá)CR的有15例(75%)，2個(gè)療程達(dá)CR的有4例(20%)。獲得CR患者有4例進(jìn)行了自體造血干細(xì)胞移植，2例進(jìn)行了異體造血干細(xì)胞移植，到隨訪結(jié)束時(shí)有6例(30%)復(fù)發(fā)，其中5例(25%)為骨髓復(fù)發(fā)，1例(10%)為髓外復(fù)發(fā)，11例(55%)死亡，9例(45%)存活，平均EFS為(19.25±15.32)個(gè)月，平均RFS為(18.74±15.31)個(gè)月，平均OS為(20.80±15.39)個(gè)月。6例進(jìn)行造血干細(xì)胞移植患者4例(66.67%)存活，2例(33.33%)死亡，平均EFS為(22.00±12.38)個(gè)月，平均RFS為(20.83±12.58)個(gè)月，平均OS為(30.00±17.02)個(gè)月，從我們的數(shù)據(jù)可以看出造血干細(xì)胞移植可以改善性染色體缺失AML患者的預(yù)后，延長患者生存時(shí)間。但不足之處是我們的病例數(shù)量太少，還需多中心的大量性染色體缺失病例來驗(yàn)證。

綜上所述，性染色體缺失AML患者以伴有t(8；21)(q22；q22)易位和AML1-ETO融合基因的M2型男性為主，有較高的WBC、骨髓原始細(xì)胞比例、血清LDH含量和偏低的HGB、PLT，常伴WT1、C-KIT和FLT3-ITD基因突變，可以通過造血干細(xì)胞移植改善性預(yù)后延長生存時(shí)間。