伍嘉寶， 劉曉華， 張欣宗， 唐運(yùn)革， 秦衛(wèi)兵△

國家衛(wèi)生健康委員會男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 1中心實(shí)驗(yàn)室， 2男性科(廣東廣州 510600)

不孕不育已逐漸成為全球性的健康問題，不孕不育的男性因素約占45%～50%，而精子質(zhì)量異常是男性不育的重要因素之一[1]。弱精子癥作為精子質(zhì)量異常最常見的類型，是困擾許多育齡夫婦的一個重要問題。根據(jù)WHO《人類精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》第五版診斷標(biāo)準(zhǔn)，弱精子癥是指精液參數(shù)中前向運(yùn)動精子百分率<32%的病癥，其病因復(fù)雜。已知的弱精子癥主要病因有生殖系統(tǒng)炎癥、內(nèi)分泌失調(diào)、免疫因素、精索靜脈曲張、微量元素缺乏等因素，但有相當(dāng)一部分弱精子癥患者的病因不明，目前藥物不能很好地改善弱精子癥患者的精液質(zhì)量，弱精子癥的發(fā)病機(jī)制有待深入研究。文獻(xiàn)報(bào)道煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)存在于人類及小鼠精子，小鼠精子nAChRs表達(dá)降低與精子活力降低有關(guān)[2-3]。目前，國內(nèi)外尚未有人精子nAChRs與精子活力相關(guān)性報(bào)道。本文研究了煙堿樣乙酰膽堿受體在弱精子癥精子與正常精子中的表達(dá)差異，旨在為開發(fā)新型治療弱精子癥藥物提供基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年8月至2019年5月廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院)部分就診患者精液標(biāo)本，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)行精液分析，按照入組標(biāo)準(zhǔn)選擇入組。弱精子癥入組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)WHO《人類精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3次檢測前向運(yùn)動率<32%，其他精液常規(guī)參數(shù)(液化時間、精液量、精子濃度、形態(tài)、pH值)無異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他精液常規(guī)參數(shù)(液化時間、精液量、精子濃度、形態(tài)、pH值)異常，臨床病歷資料不全。正常精液標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)WHO《人類精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3次檢測前向運(yùn)動率≥32%，其他精液常規(guī)參數(shù)(液化時間、精液量、精子濃度、形態(tài)、pH值)無異常。本實(shí)驗(yàn)弱精子癥組入組31例，年齡(28.16±6.12)歲；正常對照組36例，年齡(27.77±4.56)歲。本研究經(jīng)廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 nAChRA7兔抗人抗體IgG(Abcam)，山羊抗兔抗體IgG(Bioworld)，乙酰膽堿(MCE)，Percoll密度梯度液(GE Healthcare)，RIPA(Thermo Fisher)，蛋白酶抑制劑(MCE)，Tris-甘氨酸電泳緩沖液、TBST液(Solarbia)，Trans-blot TURBO轉(zhuǎn)膜套裝(Biorad)。

1.3 Western blot檢測弱精子癥及正常精子中nACh受體表達(dá) Percoll密度梯度離心法純化分離精子，取分離純化后的精子細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。制備10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人一抗nAChRA7 IgG(1∶ 700，Abcam) 4℃孵育過夜，辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶ 5 000，Bioworld) 37℃孵育1 h，洗滌后于凝膠成像系統(tǒng)顯示目的條帶，采集數(shù)據(jù)。

1.4 計(jì)算機(jī)輔助的精液分析系統(tǒng)分析精子的運(yùn)動參數(shù) 觀察添加乙酰膽堿前正常精液和弱精子癥精液精子運(yùn)動參數(shù)。對比觀察體外正常精液和弱精子癥精液加入200 nmol乙酰膽堿30 min后運(yùn)動參數(shù)變化。主要檢測指標(biāo)包括前向運(yùn)動率、曲線速度、直線速度、直線性、線性指數(shù)、振動指數(shù)、頭部側(cè)向振幅及鞭打頻率等。

2 結(jié)果

2.1 弱精子癥精子與正常精子中nAChRA7的表達(dá)差異 Western blot檢測結(jié)果顯示弱精子癥組nAChRA7的蛋白表達(dá)量較正常對照組顯著下降(圖1)。Western blot檢測結(jié)果半定量分析灰度值測量結(jié)果以正常對照組設(shè)定為100%，弱精子癥組表達(dá)為正常對照組的(52.29±10.82)%(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1、2:正常對照組；3、4、5：弱精子癥組

圖1Westernblot檢測弱精子癥組及正常對照組的nAChRA7蛋白表達(dá)

*P<0.05

圖2Westernblot檢測弱精子組及正常對照組nAChRA7蛋白表達(dá)測量灰度值百分比圖

2.2 乙酰膽堿對體外正常精子和弱精子癥精子運(yùn)動的影響 在正常精液和弱精子癥精液中分別加入200 nmol/L乙酰膽堿，發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿能顯著提高弱活力精子的前向運(yùn)動率(P<0.01)，而直線速度、線性指數(shù)、直線指數(shù)、振動指數(shù)和鞭打頻率也有不同程度的增加(P<0.01)。乙酰膽堿對正常精子活力沒有顯著性影響。見表1。

項(xiàng)目弱精子癥組正常對照組空白對照(n=31)加乙酰膽堿(n=31)空白對照(n=36)加乙酰膽堿(n=36)前向運(yùn)動(%)16.23±7.3919.26±8.48?50.54±6.3250.93±6.26非前向運(yùn)動(%)10.27±3.1810.23±2.8412.24±3.9412.36±3.90不運(yùn)動(%)73.50±7.4870.51±8.57?37.22±7.8436.70±7.67曲線速度(μm/s)41.17±9.3443.60±9.80?65.19±8.2365.24±7.95直線速度(μm/s)21.58±7.9825.18±8.97?36.31±2.9436.61±3.19平均速度(μm/s)28.39±7.7330.68±7.97?44.75±2.3945.09±3.11線性指數(shù)(%)50.64±8.6955.01±9.97?60.62±10.9661.02±10.42直線指數(shù)(%)74.12±8.2277.91±9.21?81.97±6.8382.25±6.29振動指數(shù)(%)67.62±5.1371.24±5.59?74.17±9.0374.69±9.36頭部側(cè)向振幅(μm)2.07±0.442.04±0.452.61±0.732.67±0.69鞭打頻率(Hz)7.52±1.087.68±1.058.36±0.888.31±1.04

*與空白對照組比較P<0.01

3 討論

精子活力是指精液中呈前向運(yùn)動精子所占的百分率。由于只有具有前向運(yùn)動的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以精子活力是目前評定精液品質(zhì)優(yōu)劣的常規(guī)檢查的主要指標(biāo)之一。弱精子癥是臨床上最常見的導(dǎo)致男性不育的原因之一，其病因目前尚不清楚。

乙酰膽堿受體參與人類多種生理功能，主要在神經(jīng)系統(tǒng)及肌肉組織起到重要作用。已證明多種人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由于nAChRs基因遺傳變異的結(jié)果, 如先天性肌無力、常染色體顯性夜發(fā)癲癇及精神分裂癥、帕金森病都在某種程度上與nAChRs有關(guān)[4-7]。乙酰膽堿受體分為毒蕈堿型受體(M受體——G蛋白偶聯(lián)型受體)和煙堿型受體(N受體——離子通道型受體)，煙堿樣乙酰膽堿受體廣泛表達(dá)在肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)，在非神經(jīng)組織如精子中也有表達(dá)。精子中的煙堿樣乙酰膽堿受體與人體其它部位的乙酰膽堿受體表達(dá)亞基不同，僅表達(dá)α3、α5、α7、α9及β4亞基，表達(dá)位置在中段，頸部，頂體后區(qū)[2]。前人的實(shí)驗(yàn)表明，小鼠精子上存在乙酰膽堿受體，體外精液添加乙酰膽堿可提高小鼠精子活力，而乙酰膽堿抑制劑可抑制之[2]，敲除小鼠nAChRsɑ7亞基基因CHRNA7，發(fā)現(xiàn)小鼠精子活力顯著下降，提示乙酰膽堿受體與精子活力密切相關(guān)[3]。目前，國內(nèi)外尚未有人精子煙堿樣乙酰膽堿受體與精子活力相關(guān)性報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)表明，弱精子癥患者精子nAChRA7的蛋白表達(dá)量較正常對照組顯著下降，提示nAChRs表達(dá)水平與精子活力相關(guān)，nAChRs表達(dá)下降可能是人類弱精子癥的病因之一。乙酰膽堿顯著增強(qiáng)弱精活力精子的運(yùn)動能力，提示弱精活力精子乙酰膽堿受體表達(dá)減少可能導(dǎo)致精子對乙酰膽堿敏感性降低，活動能力減弱。

煙堿樣乙酰膽堿受體作為離子通道偶聯(lián)的受體，主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外Ca2+、Na+和K+的流動，與細(xì)胞內(nèi)鈣信號途徑密切相關(guān)。在肌肉細(xì)胞中的研究表明，煙堿樣乙酰膽堿受體可識別并結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，并激活受體偶聯(lián)的離子通道，增大Ca2+跨膜進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會[8]，胞漿內(nèi)的Ca2+濃度升高引起肌肉收縮。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與精子活力相關(guān)[9-10]。在生理濃度范圍內(nèi)，鈣離子增高促進(jìn)精子活力。人類精子鞭毛擺動頻率與精子胞內(nèi)鈣振蕩顯著相關(guān)[11]。精子超活化也與多種精子表達(dá)的Ca2+通道相關(guān)[12]。高濃度乙酰膽堿誘發(fā)小鼠體外精子產(chǎn)生誘發(fā)性頂體反應(yīng)，其主要機(jī)制為胞內(nèi)Ca2+增加，提示nAChRs與胞內(nèi)鈣信號密切相關(guān)[13-14]。nAChRs影響人精子活力的機(jī)制是否與胞內(nèi)鈣信號相關(guān)，尚待進(jìn)一步證實(shí)。