吳貽平, 梁敏珊, 張瀟涵, 劉情英, 羅曦，米賢軍

1廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院病理科(廣東珠海 519000)； 2中山市博愛(ài)醫(yī)院病理科(廣東中山 528400)

骨肉瘤(osteosarcoma)是最常見(jiàn)的惡性骨病，原發(fā)于長(zhǎng)骨中，以高轉(zhuǎn)移傾向?yàn)樘卣?，常?jiàn)于兒童與青少年[1-2]。由于化療藥物的迅速發(fā)展，近幾年來(lái)骨肉瘤患者的5年生存率明顯提高以及其局部骨肉瘤復(fù)發(fā)率明顯下降[3]，然而骨肉瘤患者的預(yù)后仍然很差。骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是骨肉瘤治療失敗的主要原因[4-5]。因此，我們應(yīng)該更好地了解骨肉瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制。MicroRNA(miRNA)是長(zhǎng)度為18～25 nt，廣泛表達(dá)、具有重要生物學(xué)作用的非編碼RNA。近年來(lái)，許多研究表明各種癌細(xì)胞中的miRNAs水平異常[6-8]。此外，大量的研究表明miRNAs參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬[9-10]。最新文獻(xiàn)將miRNAs與癌癥化療藥物的耐藥性聯(lián)系起來(lái)[11]。因此，靶向miRNAs逆轉(zhuǎn)耐藥性可能是一種很有前途的治療骨肉瘤的策略。MiR-125b在多種腫瘤中發(fā)揮類似于“癌基因”的作用，近幾年來(lái)的一些研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤耐藥中miR-25b也起一定作用，包括黑色素瘤[12]、卵巢癌[13]、乳腺癌[14]等。目前尚沒(méi)有關(guān)于miR-125b在骨肉瘤耐藥作用的研究。本研究自2018年5—9月以人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG-63為研究對(duì)象，探討miR-125b是否參與骨肉瘤對(duì)化療藥物的耐藥作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人骨肉瘤細(xì)胞株和人成骨細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；高糖DMEM、胎牛血清、trizol、LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；阿霉素購(gòu)自中國(guó)邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；miR-125b模擬物/陰性對(duì)照、miR-125b抑制劑/陰性對(duì)照、逆轉(zhuǎn)錄引物和定量引物購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司；CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS、MG-63和人成骨細(xì)胞株HOSB接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待融合度達(dá)80%～90%，采用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 阿霉素處理細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/孔接種于6孔板中，接種24 h后，加入含有0.5 nmol/L阿霉素的完全培養(yǎng)基中。收集暴露于阿霉素0、24、48 h的細(xì)胞，抽提RNA，檢測(cè)細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/孔接種于6孔板中，按照LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)，將100 pmol miR-125b模擬物、miRNA陰性對(duì)照和5 μL LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞耐藥性的改變。

1.5 RNA提取和cDNA合成 根據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物，根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)取1 μg總RNA在20 μL體系中合成cDNA。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用 SYBR定量PCR試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)水平。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，目的基因相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組分兩組：對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miRNA陰性對(duì)照)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物組)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加入100 μL含有0.5 nmol/L阿霉素的完全培養(yǎng)基，48 h后加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm和630 nm處的吸光值(A值)，以630 nm處A值為參照波長(zhǎng)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率(%)=(A450 nm實(shí)驗(yàn)組-A630 nm實(shí)驗(yàn)組)/(A450 nm對(duì)照組-A630 nm對(duì)照組)×100%

2 結(jié)果

2.1 miR-125b在人骨肉瘤細(xì)胞和人成骨細(xì)胞中的表達(dá)水平檢測(cè) 骨肉瘤細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平比成骨細(xì)胞表達(dá)水平低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

細(xì)胞株nmiR-125bHOSB31.000±0.028U-2OS30.546±0.025MG-6330.365±0.026

2.2 阿霉素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS和MG-63中miR-125b的表達(dá)水平影響 阿霉素處理后細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

細(xì)胞株n0 h24 h48 hU-2OS31.000±0.0860.663±0.0380.531±0.016MG-6331.000±0.0410.571±0.0220.432±0.024

2.3 下調(diào)miR-125b表達(dá)后人骨肉瘤細(xì)胞株對(duì)阿霉素敏感性的檢測(cè) 阿霉素處理后，抑制miR-125b表達(dá)后U-2OS細(xì)胞的增殖率升高約25%，見(jiàn)表3。MG-63的細(xì)胞增殖升高約30%，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表4。

細(xì)胞株n對(duì)照組抑制劑組U-2OS31.000±0.0390.623±0.030MG-6331.000±0.0240.481±0.026

細(xì)胞株n細(xì)胞存活率(%)對(duì)照組抑制劑組U-2OS3100.000±2.538123.701±1.935MG-633100.000±4.151134.516±2.174

2.4 上調(diào)miR-125b表達(dá)后人骨肉瘤細(xì)胞株對(duì)阿霉素敏感性的檢測(cè) 阿霉素處理后，上調(diào)miR-125b表達(dá)后U-2OS細(xì)胞的增殖率下降約38%，見(jiàn)表5。MG-63的細(xì)胞增殖下降約50%，結(jié)果都差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表6。

細(xì)胞株n對(duì)照組模擬物組U-2OS31.000±0.0771 530.000±111.355MG-6331.000±0.057949.667±32.868

表6 下調(diào)miR-125b表達(dá)后人骨肉瘤細(xì)胞株對(duì)阿霉素敏感性檢測(cè)

3 討論

骨肉瘤是指癌細(xì)胞能直接產(chǎn)生腫瘤骨及骨樣組織的一種惡性結(jié)締組織腫瘤，目前主要治療方法是手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)前和術(shù)后化療，部分患者化療藥物耐藥性導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重阻礙療效和生存率[4, 15]。目前有關(guān)骨肉瘤化療藥物耐藥的機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在人類癌癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，已經(jīng)在許多實(shí)體腫瘤中，發(fā)現(xiàn)診斷和預(yù)后的miRNA表達(dá)譜，許多miRNA可以作為癌基因發(fā)揮作用，這表明miRNAs可以作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。隨著骨肉瘤患者對(duì)化療藥物耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致生存率停滯，需要新的治療方案，miRNAs可能有助于骨肉瘤治療作為靶標(biāo)[16]。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-125b在腫瘤耐藥性中發(fā)揮一定的作用。Vergani等[12]的研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤威羅菲尼耐藥細(xì)胞株中miR-125b表達(dá)增加， miR-125b的表達(dá)抑制能增加黑色素瘤對(duì)威羅菲尼藥物敏感性；Kong等[13]報(bào)道卵巢癌耐藥細(xì)胞株C13*中miR-125b的表達(dá)明顯比藥物敏感細(xì)胞株OV2008增高，過(guò)表達(dá)miR-125b增加OV2008細(xì)胞對(duì)順氯氨鉑的耐藥性；Shi等[17]抑制miR-125b在鼻咽癌細(xì)胞的表達(dá)后，替莫唑胺處理后腫瘤細(xì)胞凋亡率上升。本研究中，增加miR-125b的表達(dá)，阿霉素處理后骨肉瘤細(xì)胞增殖率下降，該結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果相反，分析原因可能與腫瘤類型、腫瘤細(xì)胞微環(huán)境、靶基因的差異及miRNA本身作用的復(fù)雜性有關(guān)，導(dǎo)致同一miRNA在不同腫瘤甚至同種腫瘤中發(fā)揮的不同甚至完全相反的作用。鑒于此，可通過(guò)擴(kuò)大腫瘤細(xì)胞類型對(duì)miR-125b在不同類型腫瘤中的功能進(jìn)行更全面更深入的探討。

此外，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-125b對(duì)腫瘤藥物敏感性起作用，如Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-125b能抑制肺癌耐藥細(xì)胞株的耐藥性；Yuan等[19]報(bào)道下調(diào)miR-125b表達(dá)能抑制鼻咽癌細(xì)胞的多藥耐藥作用。本研究與以上研究報(bào)道一致。人骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)阿霉素處理后，miR-125b的表達(dá)顯著下降，下調(diào)miR-125b表達(dá)能明顯提高其藥物耐藥性；過(guò)表達(dá)miR-125b表達(dá)能明顯降低U-2OS細(xì)胞和MG-63細(xì)胞的藥物耐藥性。

本研究中，對(duì)miR-125b在人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS、MG-63細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性初步的探討，發(fā)現(xiàn)miR-125b可能與人骨肉瘤細(xì)胞耐藥性有關(guān)，并證實(shí)上調(diào)miR-125b能抑制人骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥作用，為骨肉瘤的治療提供了新的思路。然而，miR-125b對(duì)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥作用的具體機(jī)制尚未清楚，有待進(jìn)一步研究。