張佳琪， 榮曉慧， 亢瑞媛， 趙瑞娟， 胡育哲， 陳英姿， 胡煥煥△， 姬國杰△

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 1生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 2仁智書院(河南新鄉(xiāng) 453003)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]，近年來發(fā)病率呈明顯上升且有年輕化趨勢[2-3]。大量流行病學(xué)研究表明體育活動(dòng)水平與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系[4]。細(xì)胞培養(yǎng)研究證實(shí), 2 h急性運(yùn)動(dòng)后的血清能明顯降低MCF-7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和成瘤能力[5]，荷瘤小鼠進(jìn)行跑步訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表現(xiàn)出對(duì)腫瘤生長的抑制[6]。但是其作用的中間環(huán)節(jié)仍尚未明確。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein, mTOR)是生長因子和細(xì)胞因子下游的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞存活、增殖和分化；以mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體形式存在[7]。Rictor作為mTORC2的核心組成分，通過其下游因子調(diào)控肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)癌細(xì)胞的生長速度及生存能力[8]。2018年6—8月，本研究采用運(yùn)動(dòng)前后的血清作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，觀察細(xì)胞活力以及 Rictor mRNA 表達(dá)的差異，探討運(yùn)動(dòng)依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞生長效應(yīng)的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑儀器 乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco，美國)；二甲基亞砜(DMSO)，Trizol 細(xì)胞裂解液(Invitrogen，美國)。電子分析天平(ME204，梅特勒)、落地冷凍高速離心機(jī)(Thermo/Multifuge X1R，美國)、梯度 PCR 儀(Sensoquestlabcycler standard，德國 senso)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、電泳儀(Power Pac Universal， Bio-Rad)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每天換液1次，1.5～2 d傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 血清采集處理及應(yīng)用方法 5名志愿者于清晨空腹休息30 min后進(jìn)行靜脈釆血3 mL(普通管)，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分裝轉(zhuǎn)存于無菌EP管中，于-20℃冷藏備用，作為運(yùn)動(dòng)前血清使用；志愿者隨后進(jìn)行2 h急性運(yùn)動(dòng)(30 min熱身、1 h全身抗壓訓(xùn)練、30 min SPINNING)，采血3 mL并以上述步驟處理備用。將培養(yǎng)好的乳腺癌 MCF-7細(xì)胞分為3組，分別用含有10%標(biāo)準(zhǔn)人血清、運(yùn)動(dòng)前和急性2 h運(yùn)動(dòng)后人血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度為 3×104個(gè)/mL，以每孔 100 μL 接種于96孔板，貼壁4 h后，實(shí)驗(yàn)分為標(biāo)準(zhǔn)人血清組、運(yùn)動(dòng)前和急性2 h運(yùn)動(dòng)后人血清組，每組加入相應(yīng)的血清，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。血清作用24、48、72 h 后每孔加入MTT 5 mg/mL 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去 MTT 培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO 震蕩 10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(測定波長 490 nm)測定每孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)人血清組為空白對(duì)照計(jì)算運(yùn)動(dòng)前和急性 2 h 運(yùn)動(dòng)后人血清組細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=(1-非標(biāo)準(zhǔn)人血清組細(xì)胞平均吸光度值/人血清組細(xì)胞平均吸光度值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.5 RT-PCR法檢測各組細(xì)胞Rictor mRNA 用3種血清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h 后，收集細(xì)胞。Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以 GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行半定量 RT-PCR：Rictor上游引物5′-TTTCGGGGATTTCTGGATG-3′,下游引物5′-AAAGCCCAGTCTCATGACATT-3′,產(chǎn)物長度201 bp；GAPDH上游引物5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′,下游引物 5′-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3′，產(chǎn)物長度 662 bp。反應(yīng)體系20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，72℃ 10 min，除預(yù)變性外進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照并計(jì)算各條帶灰度。Rictor 相對(duì)表達(dá)量以 Rictor 條帶灰度值與 GAPDH 條帶灰度值之比表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取平均值記錄。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法對(duì)比運(yùn)動(dòng)前后的血清對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 在培養(yǎng)24 h后，運(yùn)動(dòng)前血清對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率普遍大于運(yùn)動(dòng)后血清對(duì)細(xì)胞的抑制率；在48、72 h后，結(jié)果相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

血清種類24 h48 h72 h運(yùn)動(dòng)前血清組44.25±1.5038.20±1.6020.07±2.00運(yùn)動(dòng)后血清組35.17±2.00?46.22±1.20?45.79±1.60?

*與運(yùn)動(dòng)前血清組比較P<0.05

2.2 RT-PCR 法對(duì)比運(yùn)動(dòng)前后的血清對(duì)細(xì)胞 Rictor mRNA 表達(dá)的影響 MCF-7 細(xì)胞經(jīng)不同組分的血清干預(yù) 48 h 后，1、2、4、5 組的結(jié)果均為運(yùn)動(dòng)前血清培養(yǎng)出的細(xì)胞 Rictor mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于運(yùn)動(dòng)后血清培養(yǎng)出的細(xì)胞(P<0.05)。而3組與其他組情況相反，在 MTT 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)也不同于別組，其結(jié)果為:在細(xì)胞處理24 h后，運(yùn)動(dòng)后血清對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率大于運(yùn)動(dòng)前血清對(duì)細(xì)胞的抑制率；在48、72 h后，結(jié)果相反。此名志愿者運(yùn)動(dòng)前后的血清培養(yǎng)細(xì)胞 48 h 后， 結(jié)果與其RT-PCR 檢測出的Rictor mRNA 表達(dá)量結(jié)果相符合，即運(yùn)動(dòng)后血清對(duì)細(xì)胞的抑制作用減弱時(shí)Rictor mRNA 表達(dá)量升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)后血清抑制 MCF-7 細(xì)胞增殖的機(jī)制之一可能是通過降低 Rictor mRNA 表達(dá)進(jìn)行的。該名志愿者的特殊之處猜測與其基因多態(tài)性相關(guān)。綜上結(jié)果：運(yùn)動(dòng)后血清對(duì) MCF-7 細(xì)胞增殖均有抑制作用， 且其抑制作用與血清作用時(shí)間存在相關(guān)性。見圖1。各組灰度值分析見表2。

M:Marker; Q:運(yùn)動(dòng)前血清培養(yǎng); H：運(yùn)動(dòng)后血清培養(yǎng); 1、2、3、4、5: 分別表示5名志愿者

血清種類志愿者 1志愿者 2志愿者 3志愿者 4志愿者 5運(yùn)動(dòng)前血清組0.955 4±0.0060.758 5±0.0110.602 0±0.0080.827 9±0.0070.809 0±0.007運(yùn)動(dòng)后血清組0.686 4±0.0110.667 2±0.0080.670 4±0.0060.794 3±0.0110.581 3±0.005

3 討論

乳腺細(xì)胞的癌變，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素多階段的復(fù)雜演變，涉及至少百種基因的功能異常。弄清導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制可以為乳腺癌的治療提供新的思路。Rictor即mTORC2的特征性支架蛋白，在腫瘤的增殖、遷移、侵襲等過程中發(fā)揮著重要作用[9]。Rictor的異常表達(dá)與人類多種類型的癌癥相關(guān)，如乳腺癌[10]、肺癌[11]、腎癌[12]、甲狀腺乳頭狀癌[13]和子宮內(nèi)膜癌[14]等。表達(dá)水平與腫物大小、TNM分期、VEGF、CD34、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在正相關(guān)[15]。在癌癥治療中下調(diào)Rictor對(duì)控制腫瘤的生長、遷移效果顯著[16]。因此，該基因可以被用來研究乳腺癌的遺傳與表達(dá)情況。

近年來，抑制血管生成，淋巴管增生、擴(kuò)張的分子靶向藥物成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，眾多的分子靶向藥相繼誕生。運(yùn)動(dòng)后的血清作為一種正處于研究階段的新型多分子靶點(diǎn)抗腫瘤的治療產(chǎn)物，其內(nèi)含有多種已知和未知的成分具有廣譜的抗腫瘤活性，并已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室研究和臨床研究中取得了理想的抗癌效果。從宏觀來講它是一種近年來備受推崇的癌癥運(yùn)動(dòng)療法[17-19]。Dethlefsen 等[5]研究中發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察到運(yùn)動(dòng)后血清能夠抑制 MCF-7(激素敏感性)和 MDA-MB-231(激素不敏感型)這兩種乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力，腎上腺素和去甲腎上腺素在其中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，它們可以通過激活具有腫瘤抑制作用的 Hippo 信號(hào)途徑以及使 YAP 磷酸化等方式抑制下游靶基因的表達(dá)。陳振國[20]認(rèn)為運(yùn)動(dòng)抑制乳腺癌還表現(xiàn)在它能夠降低體內(nèi) n-6 不飽和脂肪酸的含量，而 n-6 不飽和脂肪酸能夠抑制 n-3 不飽和脂肪酸的作用，n-3 不飽和脂肪酸能夠通過靶向作用于 mTORC1/2 信號(hào)通路從而抑制乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。血漿中C反應(yīng)蛋白、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平增加和脂聯(lián)素等抗炎癥因子減少常被作為癌癥風(fēng)險(xiǎn)的正相關(guān)指標(biāo)而使用[21-22]。有研究表明長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著減少全身炎癥因子如C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6和其他炎性因子水平[23]。另外任云會(huì)等[24]報(bào)道，在對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)治療后，其血清中原高水平與乳癌預(yù)后不良有關(guān)的Dickkpof1(DKK1)表達(dá)降低。低水平的DKK1對(duì)wnt/β-action通路的抑制作用減弱，從而使wnt/β-action通路能更好地發(fā)揮對(duì)細(xì)胞生長、發(fā)育及代謝平衡的調(diào)節(jié)作用。

因此，為了解運(yùn)動(dòng)抑癌的更多可能機(jī)制，本研究采用運(yùn)動(dòng)后的血清培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞觀察其Rictor的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)后血清可以抑制MCF-7細(xì)胞Rictor的表達(dá)，并且出現(xiàn)一定的時(shí)間依賴趨勢。結(jié)合前人研究成果[25-27]，筆者推測運(yùn)動(dòng)后血清下調(diào)Rictor表達(dá)可能是運(yùn)動(dòng)后血清抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，其具體過程我們猜測為：由于運(yùn)動(dòng)后的血清靶向抑制了 Rictor 的活性，阻斷下游 AKT 磷酸化，使其下游對(duì) TSC-2 的磷酸化作用被阻斷，TSC-1/TSC-2 能正常發(fā)揮功能，抑制 Rheb，從而使 mTOR 的激活受限，進(jìn)而抑制了 MCF-7 細(xì)胞的增殖。根據(jù)我們的研究結(jié)果可以推測: 在乳腺癌患者中應(yīng)用運(yùn)動(dòng)療法使其自身血清得到改變將有可能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，降低癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移能力，從而提高患者生存率。由于血清內(nèi)自體成分的改變是通過運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生，所以安全性較高，采取此方案的志愿者均無嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此具有較高的治療安全性。本研究結(jié)果揭示了一條運(yùn)動(dòng)后血清抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的新的信號(hào)通路，為運(yùn)動(dòng)干預(yù)療法在乳腺癌的防治應(yīng)用方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為今后乳腺癌的防治提供新的方向。