方 禎 卜文靜 許尤琪

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院暨江蘇省第二中醫(yī)院腫瘤科，南京市 210017，電子郵箱：fssda68@163.com)

全球每年有超過50萬人罹患肝癌，其中超過50%發(fā)生在中國，患者的五年自然死亡率超過95%[1]。盡管已經(jīng)有切除手術(shù)、經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化學(xué)栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)等治療手段，使得肝癌患者術(shù)后5年總生存率達到53%，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是肝癌患者術(shù)后病情惡化的主要原因和長期存活的主要障礙，術(shù)后五年復(fù)發(fā)率仍高達62%[2-4]。腫瘤轉(zhuǎn)移需要突破細(xì)胞外基質(zhì)，而尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是重要的蛋白水解酶，能有效地降解細(xì)胞外基質(zhì)[5-6]。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長、運動和形態(tài)發(fā)生的多功能因子，其受體c-Met過表達于多種腫瘤細(xì)胞，具有酪氨酸激酶活性，二者形成HGF/c-Met信號通路，刺激多種腫瘤細(xì)胞的增殖與運動[7-9]。越來越多的研究表明中藥健脾活血方能夠改善癌癥預(yù)后，減少復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[10-12]，其是否通過HGF/c-Met通路影響uPA的合成從而抑制癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移值得進一步探索。本研究探討健脾活血方含藥血清對缺氧狀態(tài)下肝癌細(xì)胞活性及增殖的影響，以及其抑制癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能分子機制，旨在為中醫(yī)改善肝癌預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)細(xì)胞活性檢測試劑盒(上海碧云天公司，產(chǎn)品編號：C0009)，Transwell小室(美國Corning公司，孔徑：8.0 μm)，Cell-Light EdU Apollo567試劑盒(銳博生物，貨號：C10310-1)，12孔細(xì)胞培養(yǎng)版(美國Corning公司，型號：Costar 3513)，人uPA酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0535)，人HGF酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0369)，兔源c-Met一抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM4116)，β-肌動蛋白一抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM0627)，增強型RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0102-100)，羊抗兔過氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1056)，超敏電化學(xué)發(fā)光即用型底物(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1171)，免疫印跡試驗專用一抗二抗稀釋液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1017)，HGF與c-Met實時熒光定量PCR反轉(zhuǎn)錄引物由上海生工生物合成，TRIzol試劑(美國Thermo Fisher公司，貨號：15596026)，焦碳酸二乙酯水(上海碧云天公司，貨號：R0021)，SYBR Green qPCR Mix(上海碧云天公司，貨號：D7260)，氯化鈷(Sigma公司，貨號：C8661-25G)。R500通用型小動物麻醉機(深圳瑞沃德公司)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721購自北納生物細(xì)胞庫(貨號：BNCC338089)。細(xì)胞于含10%胎牛血清(美國Gibco公司，批號：16000044)的RPMI-1640(美國Gibco公司，批號：C11875500BT)培養(yǎng)基中，放置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含0.25%乙二胺四乙酸的胰酶消化后傳代，取對數(shù)生長期融合度約80%左右的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗動物 SD大鼠20只(雌雄各半)購自南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(蘇)2005-0009]，6月齡，平均體重為300 g。飼養(yǎng)條件：相對濕度45%～65%，溫度21℃～26℃，光暗循環(huán)各12 h，且所有大鼠可自由獲取水和食物。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為實驗組及對照組。

1.4 健脾活血方含藥血清的制備 健脾活血方由以下中藥組成：太子參30 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，山藥10 g，茵陳15 g，薏苡仁30 g，莪術(shù)15 g，石打穿15 g，半枝蓮15 g，丹參15 g，苦參10 g。該方水煎后將藥液濃縮，得到生藥量為2 g/mL的藥液。給予實驗組大鼠灌胃健脾活血藥液，以成人劑量為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)體表面積換算得到給藥劑量，以4倍量給藥，即約18 mL/(kg·次)，2次/d，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后使用異氟烷進行氣體麻醉，無菌條件下從心臟取血，以300 r/min離心20 min分離血清，0.22 μm無菌濾器過濾后在56℃水浴鍋中滅活30 min，分裝后作為實驗組血清，置于-80℃凍存?zhèn)溆谩φ战M大鼠按以上程序以等量生理鹽水灌胃，取血清為對照組血清，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 含藥血清的干預(yù)及相關(guān)指標(biāo)的檢測 實驗過程中將SMMC-7721細(xì)胞分為實驗組及對照組進行相應(yīng)的干預(yù)。

1.5.1 含藥血清對缺氧狀態(tài)下SMMC-7721細(xì)胞活性以及增殖能力的影響：分別使用MTT法與EdU試劑盒測定含藥血清對缺氧狀態(tài)下SMMC-7721細(xì)胞活性以及增殖能力的影響。(1)MTT實驗。將對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞消化計數(shù)，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×104個細(xì)胞/mL，96孔板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后分別換用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(血清濃度為10%)，并加入細(xì)胞培養(yǎng)級氯化鈷至最終濃度為150 μmol/L，以模擬TACE術(shù)后癌細(xì)胞缺氧狀態(tài)。實驗組與對照組血清各10組，每組做3個復(fù)孔。5% CO2、37℃培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后將培養(yǎng)基吸棄，每孔加入150 μL二甲基亞砜，37℃條件下振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處的A值。(2)EdU實驗。將SMMC-7721細(xì)胞以同樣的密度接種于96孔板，貼壁后分別換用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(血清濃度為10%)，并加入氯化鈷模擬細(xì)胞缺氧狀態(tài)。實驗組與對照組血清各10組，每組做3個復(fù)孔。72 h后按照1 000 ∶1的比例在培養(yǎng)基中加入EdU試劑繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄去培養(yǎng)基并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定30 min，甘氨酸溶液孵育5 min，使用0.5% TritonX-100穿透細(xì)胞。隨后每孔加入100 μL 1×Apollo避光染色30 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后使用1×Hoechst 33342反應(yīng)液染細(xì)胞核30 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。通過計算實驗組或?qū)φ战M視野內(nèi)的增殖細(xì)胞(Apollo染色為紅色熒光，Hoechst染色為藍(lán)色熒光)數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的百分比來判定細(xì)胞增殖率。

1.5.2 含藥血清對缺氧狀態(tài)下SMMC-7721細(xì)胞侵襲遷移能力的影響：使用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室測定SMMC-7721細(xì)胞的侵襲遷移能力。實驗前使用50 mg/L的Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃環(huán)境下過夜風(fēng)干。取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞消化重懸，調(diào)整密度至2×105個細(xì)胞/mL，加100 μL細(xì)胞懸液至Transwell上室。24孔板下室每孔分別加入600 μL含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(血清濃度為10%)，并在上室中加入氯化鈷模擬細(xì)胞缺氧狀態(tài)，37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。24 h后取出小室，用棉簽將上層基質(zhì)膠與未遷移的細(xì)胞擦除，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，再次用磷酸緩沖鹽溶液漂洗后，鏡下觀察SMMC-7721細(xì)胞侵襲遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。實驗重復(fù)3次。

1.5.3 含藥血清對SMMC-7721細(xì)胞分泌uPA的影響：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中uPA的含量。分別使用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(血清濃度為10%)培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，實驗組與對照組血清各10個孔；72 h后取上清，離心去除沉淀后-20℃保存?zhèn)溆谩舛葹?2.5～4 000 pg/mL的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品與稀釋5倍后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清液加入預(yù)包被抗人uPA抗體的96孔板中，每孔加入100 μL，37℃反應(yīng)90 min，使其中的uPA與抗體結(jié)合；隨后每孔加100 μL生物素標(biāo)記的抗人uPA抗體，37℃反應(yīng)60 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物工作液100 μL反應(yīng)30 min。最后每孔加入90 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色液避光反應(yīng)30 min，加100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺終止液終止反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的A值。

1.5.4 含藥血清對SMMC-7721細(xì)胞上清HGF水平的影響：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HGF的水平。細(xì)胞上清的制備同1.5.3。將濃度為125～8 000 pg/mL的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品與稀釋5倍后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清液加入預(yù)包被抗人HGF抗體的96孔板中，每孔加入100 μL，37℃反應(yīng)90 min，使其中的HGF與抗體結(jié)合；隨后每孔加100 μL生物素標(biāo)記的抗人HGF抗體，37℃反應(yīng)60 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物工作液100 μL反應(yīng)30 min。最后每孔加入90 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色液避光反應(yīng)20 min，加100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺終止液終止反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的A值。

1.5.5 含藥血清對SMMC-7721細(xì)胞c-Met蛋白表達水平的影響：采用免疫印跡試驗檢測SMMC-7721細(xì)胞上清c-Met蛋白表達水平。分別使用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(血清濃度為10%)培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，實驗組與對照組血清各10個孔。72 h后，吸棄培養(yǎng)基并使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，每孔加入400 μL含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，4℃環(huán)境下以12 000 r/min離心5 min后收集上清。以含50 ng總蛋白的溶液體積為上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，c-Met一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗3次。等體積混合電化學(xué)發(fā)光底物中的A液與B液，每平方厘米膜使用0.1 mL工作液，室溫下孵育1～2 min。置于Tanon-5200化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)內(nèi)顯影，選用β-肌動蛋白為內(nèi)參蛋白。

1.5.6 含藥血清對SMMC-7721細(xì)胞HGF與c-Met mRNA表達的影響：采用實時熒光定量PCR檢測HGF與c-Met mRNA的表達水平。分別使用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(血清濃度為10%)培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞72 h，實驗組與對照組血清各10個孔。取實驗組與對照組各約1×107個細(xì)胞，與1 mL TRIzol試劑一并加入離心管中，充分吹打，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s后靜置2 min，4℃環(huán)境下以12 000 r/min離心15 min，取上層水相。加入0.5 mL異丙醇后混勻，室溫靜置10 min，4℃下再次12 000 r/min離心10 min，棄去上清。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗滌沉淀，4℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清。沉淀自然干燥后，使用適量焦碳酸二乙酯水溶解待用。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參。HGF上游引物序列為5′-GAGAGAGGCGAGGAGAAACG-3′，下游引物序列為5′-GTGTAGCCCCAGCCGTAAAT-3′；c-Met上游引物序列為5′-ACGTACGGTGTCTCCAGCAT-3′，下游引物序列為5′-CTGGAGACACAGGATAGGAA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3′，下游引物序列為5′ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT-3′。利用引物與脫氧核糖核苷三磷酸合成cDNA后，使用QuantStudio實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行實時定量PCR，反應(yīng)體系為SYBR Green 1染料10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸0.5 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 32.5 μL。反應(yīng)條件為93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 2 min，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后得到目的基因/內(nèi)參基因Ct值，使用2-△△Ct法對RNA水平進行相對定量?！鳌鰿t =[待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均 Ct 值]-[對照組目的基因平均 Ct 值-對照組內(nèi)參基因平均 Ct 值]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組SMMC-7721細(xì)胞活性以及增殖能力比較 實驗組SMMC-7721細(xì)胞的A值及細(xì)胞增殖率均低于對照組(均P<0.05)，見表1及圖1。

表1 兩組SMMC-7721細(xì)胞A值及細(xì)胞增殖率比較(x±s)

圖1 兩組SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力

注：Apollo染料將增殖細(xì)胞的細(xì)胞核染為紅色熒光，Hoechst染料將所有細(xì)胞的細(xì)胞核染為藍(lán)色熒光，Merge為融合圖像，圖中標(biāo)色標(biāo)尺為50 μm。

2.2 兩組SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力比較 實驗組SMMC-7721細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為(147.807±24.213)個，少于對照組的(362.945±32.735)個(t=29.734，P=0.001)。

2.3 兩組細(xì)胞培養(yǎng)液上清HGF水平及細(xì)胞中c-Met蛋白表達水平的比較 實驗組細(xì)胞培養(yǎng)液上清HGF水平及細(xì)胞中c-Met蛋白表達水平均低于對照組(均P<0.05)，見表2及圖2。

表2 兩組細(xì)胞培養(yǎng)液上清HGF水平及細(xì)胞中c-Met蛋白表達水平比較(x±s)

圖2 兩組c-Met蛋白表達情況

2.4 兩組細(xì)胞HGF與c-Met mRNA相對表達水平比較 實驗組細(xì)胞HGF與c-Met mRNA的相對表達水平均低于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組細(xì)胞HGF與c-MetmRNA相對表達水平比較(x±s)

2.5 兩組細(xì)胞uPA分泌水平比較 實驗組上清液uPA濃度為(667.356±103.103)pg/mL，低于對照組的(1 273.467±117.207)pg/mL(t=14.139，P=0.001)。

3 討 論

原發(fā)性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率。近年來TACE術(shù)治療肝癌的短期療效已經(jīng)得到普遍肯定，廣泛用于臨床。但有研究表明，TACE術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率較高，長期療效尚不確定[13-15]。目前，有越來越多關(guān)于癌癥的研究專注于深度挖掘中藥古方，有研究表明，健脾活血方有助于降低肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率[16]。因此本研究探究健脾活血方在減少肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用，以及可能的機制。

由于肝癌TACE術(shù)后靶動脈閉塞，腫瘤組織處于缺血缺氧的環(huán)境，其生物學(xué)行為勢必發(fā)生改變[17-18]。為充分模擬這一變化，本研究首先在體外使用細(xì)胞培養(yǎng)級氯化鈷來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的化學(xué)缺氧狀態(tài)[19]。MTT實驗與Edu實驗結(jié)果顯示，實驗組SMMC-7721細(xì)胞的A值及細(xì)胞增殖率均低于對照組(均P<0.05)，提示在缺氧狀態(tài)下，健脾活血方含藥血清可抑制SMMC-7721細(xì)胞的活性及增殖能力。而低活性與增殖能力的癌細(xì)胞可降低癌癥的復(fù)發(fā)率，因此健脾活血方或可降低肝癌TACE術(shù)后的復(fù)發(fā)率。此外，Transwell實驗結(jié)果顯示，實驗組侵襲遷移到下室的SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量少于對照組(P<0.05)，這提示在缺氧狀態(tài)下，健脾活血方含藥血清可以降低SMMC-7721細(xì)胞的侵襲遷移能力。因此TACE術(shù)后應(yīng)用健脾活血方或能降低肝癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移率。

HGF/c-Met信號通路參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、運動。本實驗結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞培養(yǎng)液上清HGF水平及細(xì)胞中HGF mRNA表達水平、c-Met蛋白及其mRNA表達水平均低于對照組(均P<0.05)，提示在健脾活血方含藥血清的作用下，SMMC-7721細(xì)胞的HGF及其受體c-Met的表達下調(diào)，HGF/c-Met通路被抑制。前期研究已經(jīng)證實，uPA主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中起到了重要作用[20]。本研究的酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示，實驗組上清液uPA濃度低于對照組(P<0.05)，表明健脾活血方含藥血清可降低SMMC-7721細(xì)胞分泌uPA的水平，從而阻止SMMC-7721細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。以上結(jié)果表明健脾活血方或通過抑制HGF/c-Met通路、調(diào)控細(xì)胞分泌uPA的水平，阻止肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，健脾活血方含藥血清能夠抑制缺氧狀態(tài)下肝癌細(xì)胞的活性及增殖能力。其機制或為通過抑制HGF/c-Met通路并減少肝癌細(xì)胞分泌uPA的水平，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移。由于健脾活血方成分較為復(fù)雜，下一步研究可以更加深入地分析藥物成分及其作用，為改善肝癌患者預(yù)后提供更多理論依據(jù)。