李 爽，王錦鑫，李 研，張書馨，陳欣良，張 可，王 潔，刁全平，郭 華

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007)

核苷類化合物是生命體最基本的元素之一，參與人體細(xì)胞能量、結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)作用，具有抗血小板凝聚、增強(qiáng)人體免疫力和抗病毒等多種活性功能[1-3]。蘑菇在歐洲被稱為“植物肉”，在日本被稱為“食品的巔峰”，許多國家把蘑菇看成“菜中之王”，具有極高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[4-5]。核苷類化合物是蘑菇中的生物活性物質(zhì)之一，因此本實(shí)驗(yàn)對幾種蘑菇中的核苷類化合物進(jìn)行HPLC分析[6-7]，為今后研究蘑菇中的核苷類成分提供一定參考價(jià)值。

1 儀器、試劑與材料

儀器：1525型高效液相色譜儀，配2996型二極管陣列檢測器(美國waters公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；CQX25-24超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)；LFP-800T 粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；沃特浦分析型純水機(jī)WP-UP-LH-10(成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司)。

試劑：胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)，甲醇(色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司)。

材料：滑子蘑、香菇、草菇、杏鮑菇、松乳菇、楊樹菇、榛菇、銀耳、木耳(2018年購于鞍山市)，陰干，粉碎過80目篩保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 蘑菇中核苷類化合物的測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱，Supersil ODS2 C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相為甲醇-水梯度洗脫：甲醇(A)-水(B)：0→10 min 1%～5%A；10→15 min 5%～15%A；15→20 min 15%～20%A；20→30 min 20%～30%A；流速，1.0 mL/min；檢測波長，259 nm；柱溫，30℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精確稱取胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷五種標(biāo)準(zhǔn)品各2.5 mg，用水定容至25 mL容量瓶中，得混合核苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各核苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為100 μg/mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 樣品溶液的制備

精確稱取9種蘑菇樣品各1 g于錐形瓶中，加30 mL水超聲提取30 min，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶后用水定容，0.45 μm濾膜過濾，待測。

2.1.4 測定方法

按2.1.1 色譜條件下的測定方法對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液進(jìn)行HPLC分析，其標(biāo)準(zhǔn)品和樣品HPLC 色譜圖如圖 1和圖2所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 樣品(香菇)色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察

表1 五種核苷的線性關(guān)系

取2.1.2項(xiàng)下的混標(biāo)溶液，稀釋按濃度梯度進(jìn)樣分析，縱坐標(biāo)為進(jìn)樣峰面積(y,AU*S)，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度(x,μg/mL)。結(jié)果見表1，表明5種核苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線在10 ～100 μg/mL的線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。

2.2.2 精密度考察

取2.1.2項(xiàng)下的同一濃度混標(biāo)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定混合核苷溶液的峰面積，計(jì)算胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷各自的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為1.21%、0.54%、0.61%、0.53%、1.31%。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，該實(shí)驗(yàn)的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性考察

選擇香菇樣品做穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將已制備好的香菇樣品溶液進(jìn)行HPLC分析，在0、3、6、9、12、24 h測定峰面積，計(jì)算香菇樣品中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.43%、0.72%、1.14%、1.37%、0.96%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，24 h之內(nèi)各核苷化合物穩(wěn)定，可以進(jìn)行色譜分析。

2.2.4 重復(fù)性考察

準(zhǔn)確稱量香菇樣品6份，按照2.1.3方法進(jìn)行處理，再按照2.1.1的色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定五種核苷的峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，香菇樣品中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.43%、1.32%、1.22%、1.33%、1.25%，該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精確稱量3份香菇樣品,每份1 g，加入相應(yīng)的核苷對照品，按照2.1.3方法進(jìn)行處理，測定加標(biāo)回收率。測得胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷的平均回收率分別為98.78%、100.57%、100.05%、99.89%、100.13%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.95%、2.83%、2.31%、3.09%、2.73%，能夠滿足分析要求。

2.3 樣品的測定

取9種蘑菇樣品粉末1g，按照2.1.3的制備方法，并在2.1.1的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各核苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中核苷含量(mg/100g)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇了草菇、楊樹菇、松乳菇、香菇、榛菇、滑子蘑、杏鮑菇、銀耳、木耳等9種常見的蘑菇，用HPLC測定其中5種核苷(尿苷、肌苷、鳥苷、胞苷、腺苷)的含量，9種蘑菇中胞苷、肌苷、鳥苷含量最高為松乳菇，含量分別為159.54 mg/100 g，257.11 mg/100 g，235.79 mg/100 g，尿苷含量最高為楊樹蘑，含量為491.24 mg/100 g，腺苷含量最高為滑子蘑，含量為207.25 mg/100 g，加標(biāo)回收率在98.78%～100.57%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.31%～3.09%之間，該方法可用于HPLC同時(shí)測定蘑菇中5種核苷類化合物含量。