賈麗娜 彭效祥 李明萱 羅淑萍 張云芳 趙榮蘭

(濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系納米醫(yī)學技術(shù)研究所，濰坊醫(yī)學院臨床檢驗診斷學山東省“十二五”高校重點實驗室，濰坊 261053)

近年來嘌呤能離子通道型受體(Purinergic ligand-gcotedion channel 7 receptor，P2X7R)已成為眾多學者廣泛關(guān)注的熱點，由起初在神經(jīng)系統(tǒng)的初步研究發(fā)展到在多個系統(tǒng)炎癥性疾病的廣泛研究。P2X7R是以ATP為天然配體的非選擇性陽離子通道，在組織損傷、感染、腫瘤微環(huán)境等伴隨炎癥發(fā)生時，受損細胞和死亡細胞釋放ATP使離子通道打開，細胞內(nèi)外的陽離子濃度以及流動方向發(fā)生改變，細胞膜發(fā)生去極化使膜的通透性發(fā)生改變，引起炎癥物質(zhì)如NO、IL-1β、IL-18、TNF-α等釋放進而參與多個系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。 P2X7R胞外環(huán)上含有ATP結(jié)合位點，研究顯示抗P2X7R胞外結(jié)構(gòu)域抗體可競爭性結(jié)合ATP結(jié)合位點從而阻斷該受體的激活，如抗P2X7R胞外結(jié)構(gòu)域抗體與P2X7R胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制巨噬細胞的死亡；在破骨細胞向多核巨噬細胞的融合過程中也可被抗P2X7R胞外結(jié)構(gòu)域抗體阻斷[1,2]。除此之外，利用抗P2X7R胞外段結(jié)構(gòu)域抗體，通過流式細胞技術(shù)、免疫組織化學技術(shù)及蛋白印跡技術(shù)等可檢測多種免疫細胞及組織中P2X7R表達情況[3]，為研究P2X7R在多種炎癥性及免疫性疾病中的作用及機制提供了重要幫助。鑒于上述抗P2X7R胞外段結(jié)構(gòu)域抗體的廣泛作用，許多研究者嘗試制備抗P2X7R單克隆抗體，但其結(jié)合活性不是很理想[4]，為此本研究嘗試制備高親和性的抗P2X7R胞外段ATP結(jié)合域抗體，為進一步制備抗人P2X7R胞外段單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器與試劑 DNA合成儀(Bioauto-maion，中國)；ABI 9700 PCR 儀(ABI，美國)；核酸電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，中國)；XO-1200D 超聲細胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司，中國)；GL21M 高速冷凍離心機(寧波新芝生物科技有限公司，中國)；臺式高速離心機(Eppendorf，美國)，DYY-6C電泳系統(tǒng)(南京大學普陽分析儀器廠，中國)；BE-1100 四維旋轉(zhuǎn)混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國)；QHZ-98A臺式全溫搖床(太倉市華美生化儀器廠，中國)；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨(Sigma，美國)；二硫蘇糖醇(DTT)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、還原型谷胱甘肽(GSH)、(氧化型)谷胱甘肽(GSSG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化鈉(NaCl)、甘油(Glycerol)、咪唑(Imidazole)(BBI，美國)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)；T4 DNA 連接酶、高保真 DNA 聚合酶[生物工程(大連)有限公司，中國]；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；Ni-IDA瓊脂糖凝膠、ECL 試劑盒、SDS-PAGE 和 WB Marker[德泰生物科技(南京)有限公司，中國]。

1.2方法

1.2.1P2X7R胞外段蛋白編碼序列的擴增 根據(jù)GenBank收錄的人P2X7R基因(GenBank 登記號：NP_002553.3)序列，確定其胞外段包含ATP結(jié)合位點的編碼序列區(qū)域，采用德泰生物的密碼子優(yōu)化軟件 MaxCodonTMOptimization Program (V13)對鎖定的P2X7R胞外段蛋白氨基酸編碼序列進行優(yōu)化，共設(shè)計14條引物，引物序列見表1，在第1條和第14條引物設(shè)計時分別加入NdeⅠ和HindⅢ酶切位點，使用高保真DNA聚合酶進行重疊PCR擴增。第一輪全長PCR擴增：反應(yīng)體系中加入全部14條引物，擴增參數(shù)為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性25 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，25個循環(huán)；72℃延伸 1 min。第二輪全長PCR擴增：上述第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以第1和第14條引物為上下游引物，擴增參數(shù)同第一輪PCR擴增參數(shù)。瓊脂糖凝膠電泳后回收第二輪PCR產(chǎn)物，用于后續(xù)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建。

表1 引物序列

Tab.1 Primers used for overlapping PCR

2.2P2X7R胞外段蛋白重組表達質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切P2X7R胞外段蛋白(P2X7R蛋白)編碼序列的PCR產(chǎn)物和表達載體pET30a(+)，瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化雙酶切后的PCR產(chǎn)物及線性化載體pET30a(+)，T4 DNA連接酶4℃ 連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物接種至含50 μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16 h，挑取單個菌落，使用T7/T7 terminator 引物進行PCR鑒定，陽性菌落過夜搖菌后提取質(zhì)粒，酶切鑒定及測序分析，成功構(gòu)建pET30a-P2X7R表達質(zhì)粒。

2.3P2X7R蛋白誘導表達 將測序正確的pET30a-P2X7R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3+)表達菌株中，挑取陽性單克隆于含50 μg/ml的卡那霉素LB 培養(yǎng)基中。 37℃培養(yǎng)過夜，次日按1∶100接種至4 ml新鮮 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至 OD600 為 0.6，向試管培養(yǎng)液中加入不同終濃度IPTG，篩選出最佳誘導劑的濃度為0.2 mmol/L IPTG及最佳誘導時間為16 h。在新鮮接種的菌液OD值為0.6時，加入0.2 mmol/L IPTG，分別在15℃和37℃誘導16 h，分別取等量不同溫度誘導的菌液，SDS-PAGE分析鑒定蛋白的誘導表達。

2.4P2X7R蛋白產(chǎn)物純化 收集大量培養(yǎng)后的菌體，加入20倍體積(v/m)的緩沖液[20 mmol/L PB(pH7.2)、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Imidazole含1% Triton X-100、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF]重懸菌體。置冰浴中超聲碎菌后，12 500 r/min 4℃離心15 min，離心后分別收集上清和沉淀。碎菌后的沉淀(包涵體)緩沖液(20 mmol/L pH7.2 PB、300 mmol/L NaCl含1% Triton X-100、5 mmol/L DTT)洗滌后，使用包涵體溶解液(20 mmol/L pH7.2的PB、300 mmol/L NaCl、8 mol/L Urea、20 mmol/L 咪唑、1 mmol/L DTT)溶解包涵體后，12 500 r/min 離心收集上清。將上述兩步中收集到的上清分別以0.45 μm濾膜過濾后；分別加入平衡后的Ni-IDA柱中，旋轉(zhuǎn)混合儀4℃孵育80 min；將帶有His標簽的重組蛋白以 50、100、300 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫，分別取不同濃度咪唑洗脫的重組P2X7R蛋白進行SDS-PAGE，檢測純化后的蛋白。

2.4Western blot鑒定表達產(chǎn)物 重組P2X7R蛋白樣品進行SDS-PAGE后，再濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，1∶5 000稀釋鼠源性的抗His標簽單克隆抗體，4℃孵育過夜；TBST洗滌3次后，加入1∶6 000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠的二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗3次后，進行化學發(fā)光檢測。

2 結(jié)果

2.1P2X7R胞外段蛋白編碼序列的擴增結(jié)果 重疊PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)約900 bp左右的條帶，與預(yù)期擴增的P2X7R胞外段蛋白編碼序列片段長度相符(圖1)。

2.2P2X7R重組表達質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 P2X7R胞外段蛋白編碼序列與pET30a(+)質(zhì)粒分別經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，T4 DNA連接酶連接過夜后，轉(zhuǎn)化至Top10克隆菌株。挑取單個陽性菌落培養(yǎng)后PCR鑒定(圖2A)及提質(zhì)粒后酶切鑒定(圖2B)，瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約900 bp的插入片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 P2X7R胞外段蛋白編碼序列重疊PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis showing overlap PCR amplification of P2X7R extracellular segment protein coding sequenceNote: Lanes 1 and 2.PCR amplification product;Lane 3.DL5000.

圖2 P2X7R重組表達質(zhì)粒PCR鑒定和酶切鑒定Fig.2 Agarose gel electrophoresis for confirmation of clones by PCR and restriction enzyme digestionNote: A.PCR identification of pET30a-P2X7R recombinant plasmid.Lane 1.DL5000;Lanes 2 and 3.Amplified products.B.Restriction enzyme digestion identification of pET30a-P2X7R recombinant plasmid.Lane 1.pET30a-P2X7R recombinant plasmid;Lane 2.pET30a-P2X7R recombinant plasmid digested by NdeⅠ and HindⅢ;Lane 3.DL4500.

2.3重組P2X7R蛋白的誘導表達 將pET30a-P2X7R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3+)后，經(jīng)0.2 mmol/L IPTG分別于15℃和37℃誘導表達16 h，分別取1 ml菌液離心取沉淀，PBS重懸后加入SDS-PAGE 上樣緩沖液后，于 100℃下加熱樣品10 min，離心取上清電泳。SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導表達的重組蛋白分子量為35 kD左右(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 SDS-PAGE分析重組P2X7R蛋白的誘導溫度Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of recombinant P2X7R protein with induction temperatureNote: Lane 1.Protein marker;Lane 2.Empty bacteria of BL21(DE3+);Lane 3 and 4.Expression of recombinant P2X7R protein in 16 hours at 15℃ and 37℃.

圖4 SDS-PAGE 分析超聲碎菌上清中重組P2X7R蛋白純化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of purification of recombinant P2X7R protein in supernatant of broken bacteriaNote: Lane 1.Supernatant of broken reconstitution bacterial;Lane 2.Effluent of supernatant incubated on Ni-IDA affinity chromatographic column;Lane 3.Protein marker;Lane 4.Recombinant P2X7R protein eluted by 50 mmol/L imidazole buffer;Lanes 5-7.Recombinant P2X7R protein eluted by 100 mmol/L imidazole buffer;Lanes 8-10.Recombinant P2X7R protein eluted by 300 mmol/L imidazole buffer.

2.4重組P2X7R蛋白純化 超聲碎菌離心后，分別收集碎菌后的上清和沉淀(包涵體)；包涵體溶解液溶解后的包涵體與碎菌后收集的上清，分別經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，經(jīng)Ni-IDA親和層析柱純化，最后分別以 50、 100、 300 mmol/L咪唑緩沖液洗脫，經(jīng)超濾獲得純化的重組P2X7R蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，100 mmol/L咪唑緩沖液洗脫效果最好，重組蛋白主要存在于包涵體中(圖4、5)。

圖5 SDS-PAGE 分析超聲碎菌后包涵體中重組P2X7R蛋白純化結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of purification of recombinant P2X7R protein in inclusion body of broken bacteriaNote: Lane 1.Supernatant after dissolution of inclusion bodies;Lane 2.Effluent of supernatant incubated on Ni-IDA affinity chromatographic column;Lane 3.Protein marker;Lane 4.Recombinant P2X7R protein eluted by 50 mmol/L imidazole buffer;Lanes 5-7.Recombinant P2X7R protein eluted by 100 mmol/L imidazole buffer;Lanes 8-10.Recombinant P2X7R protein eluted by 300 mmol/L imidazole buffer.

圖6 重組P2X7R蛋白的Western blot鑒定分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant P2X7R proteinNote: Lane 1.Protein marker;Lane 2.Recombinant P2X7R protein eluted by 100 mmol/L imidazole buffer.

2.5Western blot鑒定重組P2X7R蛋白 將100 mmol/L 咪唑緩沖液洗脫的重組P2X7R蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，Western blot結(jié)果顯示，抗His標簽單克隆抗體能特異性識別35 kD左右的條帶(圖6)。

3 討論

P2X7R廣泛分布于T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞等體內(nèi)多種免疫細胞上，對多個系統(tǒng)的炎癥性疾病起調(diào)控作用。P2X7R是以配體ATP為內(nèi)源天然性激活劑的非選擇性陽離子通道。生理狀態(tài)下，胞外ATP處于較低的pmol/L～nmol/L水平；病理狀態(tài)時，胞內(nèi)ATP釋放至胞外，當其濃度大于100 μmol/L時，部分通道開放，K+外流、Ca2+、Na+內(nèi)流，膜通透性增加釋放炎性因子介導炎癥反應(yīng)，當在高濃度ATP持續(xù)刺激時，形成非選擇性質(zhì)膜孔道(Pannexinal，Panx1)，允許大分子量的物質(zhì)進入胞內(nèi)引起細胞發(fā)生凋亡[5,6]。

P2X7R調(diào)控炎性疾病的主要信號通路是發(fā)生在P2X7R激活后，如由K+外流引起的胞內(nèi)低K+可激活I(lǐng)L-1β轉(zhuǎn)化酶，P2X7R激活可活化NLRP3使半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)激活，而IL-1β轉(zhuǎn)化酶和Caspase-1都可促使炎介質(zhì)IL-1β和IL-18轉(zhuǎn)變成具有生物學功能的成熟體[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，將單核和巨噬細胞用LPS做預(yù)處理，在激活P2X7R后可使MAPK、NF-κB等信號通路開放，引起Caspase-1活化使IL-1β和IL-18分化成熟，P2X7R激活可使巨噬細胞生成活性氧(ROS)，在核苷酸受體介導的p38和JNK信號通路激活中ROS也發(fā)揮重要作用[9]。

大量研究顯示，P2X7R與多系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。①呼吸系統(tǒng)疾?。涸谛∈蠹甭赃^敏性氣道炎癥、哮喘以及香煙煙霧誘導的慢性阻塞性肺氣腫和肺部炎癥等呼吸系統(tǒng)疾病中，P2X7R表達明顯上調(diào)[10-12]。②消化系統(tǒng)疾?。涸诟鼓ぷ⑸溆晖茈恼T導的小鼠慢性胰腺炎模型中，發(fā)現(xiàn)P2X7R拮抗劑氧化ATP和亮藍-G組與正常對照組相比，胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1在基因和蛋白水平表達均顯著下降，P2X7R拮抗劑組胰腺慢性炎癥和纖維化顯著減弱，結(jié)果提示阻斷P2X7R信號通路可能成為治療慢性胰腺炎及其纖維化的新策略[13]。Panx1存在于許多類型細胞中，此通道激活后釋放的ATP可激活 P2X7R誘導炎癥性腸病的發(fā)生[14]。③心血管系統(tǒng)疾?。簞用}粥樣硬化是一種慢性炎癥，同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是心血管疾病的危險因素，病理水平的Hcy可誘導巨噬細胞高表達P2X7R，通過ATP/NLRP3信號通路使IL-1β分化成熟并參與動脈粥樣硬化的發(fā)展[15]。在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病引起的心肌梗死(Myocardial infraction,MI)灶周圍，發(fā)現(xiàn)P2X7R表達增加并激活NF-κB信號通路，導致MI后室性心律失常易感性增加[16]。在血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓時，P2X7R可引起腎小球血管阻力增加，尿鈉排泄障礙[17]。④神經(jīng)系統(tǒng)疾?。篜2X7R在腦外傷、阿爾茨海默癥、脊髓外傷和神經(jīng)性疼痛等疾病中發(fā)揮重要作用[18-20]。除此之外，P2X7R還與一些腫瘤疾病的發(fā)展密切相關(guān)，P2X7R激活可提高線粒體的氧化磷酸化效率，同時增加乳酸含量，上調(diào)幾乎所有參與糖酵解的酶和轉(zhuǎn)運體，從而促進腫瘤細胞的增殖和存活；P2X7R激活可增強PC9肺癌和 T47D乳腺癌細胞的遷移，可使前列腺癌細胞的遷移性和侵襲性增加，也可通過JNK途徑促進肝癌細胞的增殖，使用P2X7R抑制劑和基因沉默P2X7R都可抑制腫瘤細胞的增殖，另外PI3K/Akt通路也參與P2X7R依賴性腫瘤細胞的生長、侵襲性、轉(zhuǎn)移性擴散和血管生成[21]。P2X7R在乳腺癌細胞系和組織中過度表達，P2X7R-shRNA表達載體有效抑制人乳腺癌細胞MCF-7中P2X7R的表達，并誘導MCF-7凋亡和增殖水平降低[22]。在淋巴瘤的研究中，通過基因沉默小鼠淋巴樣瘤細胞P388D1中P2X7R可使T復(fù)合多肽1(Tailless complex polypeptide 1,TCP-1)下降，而下調(diào)TCP-1可以抑制體內(nèi)淋巴瘤細胞的轉(zhuǎn)移[23]。血清饑餓可提高神經(jīng)母細胞瘤細胞中P2X7R的表達，有助于維持癌細胞即使在沒有營養(yǎng)支持的情況下也處于增殖狀態(tài)，而PI3K/Akt途徑抑制可阻止血清饑餓后神經(jīng)母細胞瘤細胞中P2X7R的表達[24]。P2X7R在人胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)細胞高表達，可促進人PDAC癌細胞的增殖和遷移，P2X7R抑制劑AZ10606120可降低胰腺癌侵襲性[25]。

鑒于P2X7R在多系統(tǒng)多疾病中發(fā)揮重要作用，許多研究者嘗試利用抗P2X7R抗體去阻斷該通道的打開或者檢測組織細胞中該受體的表達[1-3,26]，借以研究P2X7R在不同疾病中的作用，因此抗P2X7R 抗體成為研究P2X7R與多種炎癥疾病關(guān)系的重要工具?，F(xiàn)有抗P2X7R抗體除結(jié)合活性受限外，其售價較高，直接限制了該抗體在體內(nèi)外實驗研究中的應(yīng)用，因此本研究致力于制備高親和性及低成本的抗P2X7R抗體，而本研究中P2X7R胞外段蛋白的成功克隆表達，為今后制備抗人P2X7R胞外段單克隆抗體奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為進一步深入研究P2X7R相關(guān)疾病的診斷和治療提供了重要的工具和思路。