李 航 楊 蝶 劉慧芝

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)處,遵義 563003 )

卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一[1]。盡管在過(guò)去數(shù)十年中卵巢癌的臨床治療策略有了顯著改善，但其5年生存率仍較低，約為35%～38%[2]。至今，關(guān)于卵巢癌的潛在發(fā)展機(jī)制尚不完全清楚。因此，闡明卵巢癌發(fā)生和進(jìn)展的具體機(jī)制對(duì)于臨床開(kāi)展新的診療方案至關(guān)重要。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[3]?；谡{(diào)控靶蛋白的功能，miRNA在腫瘤的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用，包括有細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等，進(jìn)而在腫瘤發(fā)生中扮演致癌或腫瘤抑制功能，并有望成為卵巢癌的潛在治療靶標(biāo)[4,5]。

miRNA-600是一種癌癥相關(guān)miRNA，在胃癌、急性白血病等不同癌癥中發(fā)揮抑癌作用[6，7]。然而，到目前為止，miRNA-600在卵巢癌的作用尚不清楚。因此，在本研究中，我們首先分析miRNA-600在卵巢癌及癌旁的表達(dá)情況，并分析其對(duì)卵巢癌侵襲和遷移中的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、A2780、OVCAR-3、HO-8910和人卵巢表面上皮細(xì)胞系HOSEpiC均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司；10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；miRNA-600模擬物、miRNA-600抑制劑、模擬物與抑制劑對(duì)照物均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；對(duì)氧磷酶3(Paraoxonase 3，PON3)及其對(duì)照載體等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TRIzol、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA測(cè)定試劑盒均購(gòu)自武漢生之源生物科技股份有限公司；引物序列購(gòu)自武漢天一輝遠(yuǎn)生物公司；Western blot所用PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9和GAPDH一抗及二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫組化所用PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9一抗和二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；雌性裸鼠購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2卵巢癌組織樣本收集 收集2017年1月至2018年10月我院婦產(chǎn)科經(jīng)手術(shù)治療的卵巢癌患者共50例，年齡46～68歲，平均(58.7±7.2)歲，獲取50對(duì)癌及癌旁組織(距離癌組織>3 cm)。將組織樣品快速冷凍并儲(chǔ)存在液氮中用于進(jìn)一步研究。卵巢癌患者納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除已接受免疫療法及化療或放療患者；②納入患者須獲得本人或直系家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)；③排除既往有其他惡性腫瘤史者。卵巢癌分期根據(jù)2018年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[8]。本次研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3、A2780、OVCAR-3、HO-8910和HOSEpiC細(xì)胞系均在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine 2000將miRNA-600模擬物、miRNA-600抑制劑、模擬物與抑制劑對(duì)照物、PON3及其對(duì)照載體等轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞。

1.2.3實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR) 應(yīng)用TRIzol法提取卵巢癌組織樣品和卵巢癌細(xì)胞中總RNA。使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA測(cè)定試劑盒進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定。U6和GAPDH分別作為miRNA-600和PON3的內(nèi)參。引物序列如下，miRNA-600正向：5′-CTGTGTGCCACACAGTTTG-3′，反向：5′-CGGCCCTTAACTCATTCTTT-3′；U6正向：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向：5′-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3′；PON3正向：5′-CTCGGCAGTGTGTGGGGTC-3′；反向：5′-CGAGAAACTCCTGCTTGGGG-3′；GAPDH正向：5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGC-TGA-3′；反向：5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGC-CA-3′。應(yīng)用2-ΔCT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.4Western blot 使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白，并使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。在濃度為10%的SDS凝膠上加載并分離蛋白后，將細(xì)胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗4℃孵育過(guò)夜。將對(duì)應(yīng)二抗與PVDF膜在室溫下孵育2 h。使用ECL試劑檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定 為了確定卵巢癌細(xì)胞的遷移能力，通過(guò)將相應(yīng)轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞(1×105個(gè)/孔)加至6孔板中進(jìn)行劃痕試驗(yàn)測(cè)定。隨后，用無(wú)菌塑料微量移液管尖端在細(xì)胞單層中創(chuàng)建一個(gè)均勻的劃痕。用PBS洗滌細(xì)胞并在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后，用倒置相差顯微鏡在劃痕后0 h和24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。采用Image J軟件測(cè)量劃痕后兩條細(xì)胞邊緣之間的垂直距離，計(jì)算細(xì)胞24 h遷移率，遷移率(%)=(0 h劃痕間距-24 h劃痕間距)/0 h劃痕間距×100%。

使用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲能力。將無(wú)血清培養(yǎng)基中的2×105個(gè)細(xì)胞接種到涂有基質(zhì)膠的上室中。在下室中加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑。24 h后，用棉簽輕輕除去上室中非侵入細(xì)胞，并用70%乙醇固定侵入基質(zhì)膠的細(xì)胞30 min，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫染色10 min。用倒置光學(xué)顯微鏡以200×放大倍數(shù)視野中拍攝細(xì)胞，并在5個(gè)隨機(jī)視野中計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片(約4 μm厚度)進(jìn)行脫蠟并通過(guò)二甲苯和梯度乙醇再水合，放置于3%過(guò)氧化氫一起溫育10 min以淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。然后，在室溫下用山羊血清封閉1 h，并與PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9單克隆抗體一起溫育，4℃過(guò)夜。堿性磷酸酶二抗室溫孵育1 h。最后，用二氨基聯(lián)苯胺染色切片，然后蘇木精染色。應(yīng)用ImagePro Plus對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，并按陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱評(píng)分。免疫組織化學(xué)評(píng)分=a×b，a代表陽(yáng)性細(xì)胞百分比(a=0，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；a=1，陽(yáng)性細(xì)胞為1%～10%；a=2，陽(yáng)性細(xì)胞為11%～50%；a=3，陽(yáng)性細(xì)胞為51%～80%，a=4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例達(dá)81%以上),b代表陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(b=0，陰性；b=1，弱陽(yáng)性；b=2，中度陽(yáng)性；b=3，強(qiáng)陽(yáng)性)。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 為研究miRNA-600是否與PON3的3′非翻譯區(qū)相互作用，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。將PON3的3′非翻譯區(qū)序列或突變序列克隆到pMIR-REPORT載體中。將miRNA-600模擬物或相應(yīng)的對(duì)照與報(bào)告質(zhì)粒和pRL-SV40一起轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中。48 h后測(cè)定熒光素酶活性水平。

1.2.8裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，將經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的約2×106個(gè)細(xì)胞于腹膜內(nèi)注射至6～8周齡的雌性裸鼠中。3周后處死小鼠并計(jì)數(shù)腹膜內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)。收獲每只小鼠的結(jié)節(jié)用于qRT-PCR和免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1miRNA-600在卵巢癌組織及細(xì)胞系的表達(dá)情況 與癌旁組織相比，癌組織中miRNA-600的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(6.11±1.15 vs 3.81±0.69，t=7.139，P<0.05)，見(jiàn)圖1A。且Ⅲ～Ⅳ和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者組織中miRNA-600水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見(jiàn)表1。與HOSEpiC(8.13±0.52)相比，SKOV3(4.06±0.11)、 A2780(3.87±0.35)、 OVCAR-3(2.18±0.17)、HO-8910(3.04±0.42)中miRNA-600的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(t=8.225、8.470、11.013、9.264，P<0.05)，且在OVCAR-3細(xì)胞中降低最為顯著，故選擇OVCAR-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1B。

圖1 卵巢癌組織及細(xì)胞系中miRNA-600的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of miRNA-600 in ovarian cancer tissues and cell linesNote: *.P<0.05.

表1 miRNA-600表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)

Tab.1 Association between miRNA-600 expression levels and clinical pathological features of ovarian cancer

Clinical pathologicalfeaturesnRelative expression of miRNA-600x±stPAge(year)1.2390.407>60233.95±0.70≤60273.69±0.63Tumor size1.0970.762>5 cm373.87±0.65≤5 cm133.64±0.67Staging5.1940.003Ⅰ-Ⅱ354.19±0.75Ⅲ-Ⅳ152.93±0.46Lymph node metastasis-6.3970.001Yes122.73±0.52No384.15±0.74

2.2過(guò)表達(dá)miRNA-600可抑制OVCAR-3細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移 與模擬物對(duì)照[miRNA-600：2.13±0.18；N-鈣黏素：4.78±0.69；E-鈣黏素：2.07±0.24；MMP-2：5.16±0.73；MMP-9：4.44±0.62；遷移率：(73.45±5.18)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：47.22±6.90]相比，miRNA-600模擬物[miRNA-600：7.88±0.69；N-鈣黏素：2.21±0.45；E-鈣黏素：4.67±0.20；MMP-2：2.04±0.12；MMP-9：2.39±0.20；遷移率：(37.63±3.76)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：19.34±4.63]的miRNA-600與E-鈣黏素顯著增高，而N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9、遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與抑制劑對(duì)照[miRNA-600：2.15±0.19；N-鈣黏素：1.89±0.22；E-鈣黏素：4.92±0.42；MMP-2：1.76±0.09； MMP-9： 1.88±0.12； 遷移率：(41.45±3.97)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：41.56±7.98]相比，miRNA-600抑制劑[miRNA-600：0.26±0.08；N-鈣黏素：4.67±0.60；E-鈣黏素：1.85±0.07；MMP-2：4.38±0.57；MMP-9：4.55±0.60；遷移率：(84.12±6.50)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：62.89±9.57]的miRNA-600與E-鈣黏素顯著降低，而N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9、遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 miRNA-600抑制OVCAR-3細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移Fig.2 miRNA-600 inhibits invasion and metastasis of OVCAR-3 cellsNote: A.miRNA-600 transfection effect;B.E-cadherin,N-cadherin,MMP-2,MMP-9 protein levels in different transfection groups;C，D.Cell migration ability between different transfection groups;E，F(xiàn).Cell invasion ability between different transfection groups.

2.3PON3介導(dǎo)miRNA-600對(duì)OVCAR-3細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移功能的影響 TargetScan預(yù)測(cè)PON3是miRNA-600的靶基因，且該結(jié)果在雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)中也得以驗(yàn)證，見(jiàn)圖3A、B。與模擬物對(duì)照(PON3 mRNA：6.62±0.73；PON3蛋白：14.36±1.47)相比，miRNA-600模擬物(PON3 mRNA：2.22±0.26；PON3蛋白：2.65±0.29)的PON3 mRNA與蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，與抑制劑對(duì)照(PON3 mRNA：5.96±0.94；PON3蛋白：10.13±1.34)相比，miRNA-600抑制劑(PON3 mRNA：8.98±1.54；PON3蛋白：18.76±1.98)的PON3 mRNA與蛋白水平均顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3C、F。

與模擬物對(duì)照[遷移率：(46.45±3.88)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：49.76±4.26]相比，miRNA-600模擬物[遷移率：(22.09±1.68)%； 細(xì)胞侵襲數(shù)量：26.17±3.40]的OVCAR-3細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)量均顯著降低(P<0.05)，PON3載體[遷移率：(92.11±6.05)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：77.04±7.64]的OVCAR-3細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)量均顯著增高(P<0.05)，而miRNA-600模擬物聯(lián)合PON3載體[遷移率：(55.09±4.16)%；細(xì)胞侵襲數(shù)量：52.36±5.37]OVCAR-3細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3D、E。

圖3 PON3與miRNA-600的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.3 PON3 and miRNA-600 targeting relationship verificationNote: A.TargetScan predicts miRNA-600 target gene;B.Dual luciferase reporter gene test results;C.miRNA-600 targets and regulates the expression of PON3 mRNA;D.miRNA-600 inhibits migration of OVCAR-3 cells by down-regulating PON3;E.miRNA-600 inhibits OVCAR-3 cell invasion by down-regulating PON3;F.miRNA-600 targets and regulates the expression of PON3 protein.*.P<0.05.

圖4 miRNA-600可抑制裸鼠卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及PON3表達(dá)Fig.4 miRNA-600 inhibits metastasis and PON3 expression in ovarian cancer cells in nude mice

2.4過(guò)表達(dá)miRNA-600可抑制裸鼠卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 與模擬物對(duì)照[結(jié)節(jié)重量：(2.76±0.22)g；結(jié)節(jié)數(shù)量：(13.45±2.54)]相比，miRNA-600模擬物[結(jié)節(jié)重量：(0.69±0.08)g；結(jié)節(jié)數(shù)量：4.19±0.63]處理的裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)重量和數(shù)量均顯著降低(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與模擬物對(duì)照(9.76±0.91)相比，miRNA-600模擬物(1.84±0.16)處理的裸鼠結(jié)節(jié)中PON3的免疫組化評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

3 討論

前期多篇報(bào)道指出miRNA在卵巢癌進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[4，5]。在本研究中，我們探討了miRNA-600在卵巢癌中的作用，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織和細(xì)胞系中miRNA-600分別比正常卵巢組織和細(xì)胞系顯著下調(diào)。此外，Ⅲ～Ⅳ和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者組織中miRNA-600水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。miRNA-600可通過(guò)下調(diào)PON3表達(dá)促進(jìn)E-鈣黏素表達(dá)，并下調(diào)N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并可降低異種移植裸鼠腹腔腫瘤轉(zhuǎn)移的數(shù)量和腫瘤大小。

E-鈣黏素和N-鈣黏素是評(píng)估腫瘤細(xì)胞遷移能力的兩個(gè)重要分子標(biāo)志物，E-鈣黏素是轉(zhuǎn)移抑制分子，其水平增高將降低癌細(xì)胞的遷移能力[9]；N-鈣黏素則與E-鈣黏素功能相反，其水平增高則會(huì)顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[10]。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，兩者增高會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-600能促進(jìn)E-鈣黏素，并抑制N-鈣黏素、MMP-2和MMP-9表達(dá)，提示miRNA-600具有抑制卵巢癌細(xì)胞遷移與侵襲的功能。

PON3是分子量約為40 kD的糖蛋白，已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，并可通過(guò)在癌細(xì)胞中螯合泛半醌結(jié)構(gòu)而減少腫瘤細(xì)胞線粒體中超氧化物的形成，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)其遷移與侵襲[12]。本研究通過(guò)TargetScan軟件預(yù)測(cè)miRNA-600可直接靶向作用于PON3 mRNA的3′非翻譯區(qū)，從而抑制PON3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，miRNA-600可抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞遷移與侵襲能力，其機(jī)制與調(diào)控靶基因PON3密切相關(guān)。