彭宇昀

摘要：秀麗隱桿線蟲是研究老化現(xiàn)象的重要模型生物，已經(jīng)使用了近40年，在對具有延緩衰老作用的相關(guān)藥物進行初步篩選方面具有重大貢獻。本文通過對有關(guān)文獻和實驗進行分析，就秀麗隱桿線蟲被大量應(yīng)用于篩選抗衰老化合物的原因和有關(guān)實驗展開研究，分析利用秀麗隱桿線蟲進行抗衰老藥物篩選的優(yōu)點，總結(jié)相關(guān)實驗步驟，得出秀麗隱桿線蟲細胞數(shù)目固定，與人類基因同源性較高且易養(yǎng)殖是其用于進行藥物篩選的重要原因?？偨Y(jié)出進行實驗時需要充分考慮，排除如待測的相關(guān)藥物對OP50菌液的抑制性等無關(guān)變量對實驗結(jié)果的影響。

關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲，抗衰老，篩選，原因

秀麗隱桿線蟲作為模式生物在生命科學(xué)的各項研究中使用廣泛，大量運用于抗衰老藥物的篩選。[1]

近年來，有研究提出諸如阿司匹林，二甲雙胍等常用藥物成分具有延緩人體衰老的功能，而秀麗隱桿線蟲在對這類化合物的篩選過程中起了重要作用。本文將探究秀麗隱桿線蟲被廣泛應(yīng)用于抗衰老化合物篩選的原因。

1 原因分析

1.1自身原因

1.1.1 細胞數(shù)量固定

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲在其幼蟲時期有556個體細胞和2個原始生殖細胞。秀麗隱桿線蟲的成蟲可分為：雄性個體和雌雄同體個體兩類，其中雄性成熟個體有1031個體細胞和1000個生殖細胞，雌雄同體成熟個體含有959個體細胞和2000個生殖細胞。固定的細胞數(shù)量使研究人員可以更容易對比不同化合物的作用下，同種細胞在不同個體中在藥物作用下的具體變化，減少無關(guān)變量的產(chǎn)生，使不同個體（如：用抗衰老藥物處理和不用抗衰老藥物處理的個體）的同種細胞之間差異性的比較更具有說服力。同時，可以更好的探究藥物在具體細胞中的作用方式、具體效果，探究對應(yīng)化合物具有抗衰老作用的原因。

1.1.2 生殖能力強，雌雄同體

相關(guān)文獻表明，當(dāng)秀麗隱桿線蟲的雌雄同體成熟個體自體受精時可產(chǎn)生200～300顆卵，而雄性成熟個體與雌雄同體成熟個體交配，發(fā)生異體受精時可以產(chǎn)生1000多顆卵。同時，受精過的卵孵化速度快，時間短，在25℃的條件下只需大約20個小時就可以孵化成L1期的幼蟲，秀麗隱桿線蟲的受精卵從發(fā)育到性成熟只需3天的時間。強大的生殖能力和其雌雄同體的特性保證了實驗材料的充足，和另兩種模式生物：果蠅（Drosophila melanogaster）與小鼠相同。，強大的生殖能力是他們能被選作模式生物的重要原因之一，因而現(xiàn)在被廣泛的用于各種科學(xué)研究。

1.1.3 屬于自由生活線蟲，對人體、環(huán)境無毒害作用

秀麗隱桿線蟲與大多數(shù)的線蟲不同，它是自由生活種類線蟲，不需要寄生在動植物中生存。土壤中就有秀麗隱桿線蟲的存在，其對環(huán)境沒有毒害作用。同時，作為模式生物，秀麗隱桿線蟲已被證實對人體無害，因而可以在實驗室大量培養(yǎng)，用于各種實驗。

1.1.4 個體微小，通體透明，易觀察

秀麗隱桿線蟲成蟲長約1.5mm，通體透明，可用體式顯微鏡直接進行觀察。通體透明使雌雄同體成蟲體內(nèi)的卵可被直接觀察到，為區(qū)分成蟲提供了有利條件，跟容易進行同步化。易于觀察的特點使研究人員可以更容易的判斷其運動性強弱，咽泵運動是否存在，同時也可以通過多次觸碰的方式來判斷秀麗隱桿線蟲是否死亡，對后續(xù)最長壽命、半數(shù)致死天數(shù)的統(tǒng)計和分析提供了有利條件

1.1.5 生命周期短

在20℃的條件下，秀麗隱桿線蟲在實驗室中的生命周期一般為2～3周，發(fā)育期只有幾天。較短的生命周期使篩選具有抗衰老作用的化合物的實驗周期大幅縮短，篩選效率大幅提升。1.1.7基因特點

秀麗隱桿線蟲的所有基因組已經(jīng)完成了測序，其所有基因組可以直接在網(wǎng)絡(luò)上查到，而且其藥靶基因中有60%～80%與人類基因同源。而在孟德爾人類遺傳資料庫的人類疾病基因中，秀麗隱桿線蟲也有20%以上與人類同源。在抗衰老化合物的篩選過程中，由于待測化合物數(shù)量多不同模式生物進行相關(guān)測試所需的時間和物質(zhì)成本相差較大，一般來說與人同源性越高的模式生物進行抗衰老實驗所需的時間和物質(zhì)成本也就越高。所以篩選過程按與人類基因同源性由小到大，所用時間和物質(zhì)成本由低到高進行分層篩選，一般按照酵母菌，秀麗隱桿線蟲，果蠅，小鼠的順序進行篩選。由于其藥靶基因與人類的同源性較高，進行抗衰老藥物篩選具有一定的參考價值，Petrascheck就用秀麗隱桿線蟲篩選了8.8萬個化合物，并發(fā)現(xiàn)其中有115個可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命，其較強的篩選能力也是其被廣泛使用的原因之一。[2]

1.2外圍因素

1.2.1 易養(yǎng)殖

秀麗隱桿線蟲以細菌為食，可以用另一種模式生物大腸桿菌在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。一般實驗室用OP50—NGM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，尿嘧啶缺陷型大腸桿菌只能從NGM中獲取尿嘧啶才可以生長，所以其生長速度遠低于一般大腸桿菌，它既可以為秀麗隱桿線蟲提供充足的食物，又不會因為生長過快而制約秀麗隱桿線蟲的生長。而對應(yīng)的尿嘧啶缺陷型大腸桿菌只需利用L Broth液體培養(yǎng)基培養(yǎng)就可大量制得，培養(yǎng)方法的簡單和秀麗隱桿線蟲強大的繁殖能力，為篩選化合物所需的大量線蟲提供了供應(yīng)保障。

1.2.2 同步化過程簡單，得到的同步化線蟲數(shù)量多

同步化的線蟲可以直觀的通過對比，比較出藥物對其壽命的影響。同步化秀麗隱桿線蟲的方法并不復(fù)雜，用健康成蟲、M9緩沖液、線蟲裂解液（次氯酸鈉和氫氧化鈉混合溶液），經(jīng)洗脫、裂解、離心等步驟后，即可得到大量同步化蟲卵。區(qū)分成蟲時只需利用顯微鏡對蟲體進行觀察，若發(fā)現(xiàn)蟲體中有卵即為雌雄同體秀麗隱桿線蟲成蟲

2 相關(guān)試驗方法

根據(jù)大量有關(guān)文獻和對上述原因分析，總結(jié)了相關(guān)實驗方法。

2.1 培養(yǎng)方式

秀麗隱桿線蟲可以用固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時需要制備大腸桿菌OP50相關(guān)溶液、M9緩沖液和消化液。[3]

固體培養(yǎng)基需用NGM培養(yǎng)基和1M磷酸緩沖液，液體培養(yǎng)基需S medium、S 培養(yǎng)原液、1M 檸檬酸鉀和相關(guān)金屬溶液。

2.2 檢測藥物對OP50菌液的影響

由于秀麗隱桿線蟲需要以大腸桿菌為食，若被檢測的相關(guān)藥物具有抗菌作用，則需要在實驗前進行檢測，以防止相關(guān)藥物減少秀麗隱桿線蟲的攝食量，導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）進入持久期，發(fā)揮秀麗隱桿線蟲自身的抗衰老作用。

檢測藥物對OP50菌液的影響可通過設(shè)置對照實驗進行，檢測加入了相關(guān)藥物后OP50培養(yǎng)基的OD值和不加入相關(guān)藥物的對照組OP50培養(yǎng)基的OD值并進行比較。若在細菌的對數(shù)生長期中OD值沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異，則相關(guān)藥物對OP50生長無顯著影響。

2.3 檢測秀麗隱桿線蟲對相關(guān)藥物是否有飲食偏好

對于像大多數(shù)中藥一樣具有特殊氣味的藥物，需要先分析相關(guān)藥物的特殊氣味是否會對秀麗隱桿線蟲的飲食偏好有所影響。

判斷秀麗隱桿線蟲對相關(guān)藥物是否有飲食偏好可通過設(shè)置吸引實驗，檢測并統(tǒng)計含有相關(guān)藥物的菌斑和對照組不含相關(guān)藥物的菌斑吸引的秀麗隱桿線蟲的數(shù)目有無統(tǒng)計學(xué)差異來得出有關(guān)結(jié)論。

2.4 抗衰老相關(guān)指標檢測

秀麗隱桿線蟲的生命周期可分為四個階段，生殖期、壯年期、衰老期和老年期。上述四個時期可分別通過檢測秀麗隱桿線蟲的自體受精、快速身體運動、咽部運動的結(jié)束和死亡四個階段進行區(qū)分。

2.4.1 自體受精

觀測自體受精可以每天將秀麗隱桿線蟲幼蟲進行轉(zhuǎn)移，每次轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基中并觀測培養(yǎng)基中是否有新的幼蟲出現(xiàn)，直至不再出現(xiàn)新的幼蟲，屆時可判斷秀麗隱桿線蟲已進入壯年期。

每天將秀麗隱桿線蟲進行轉(zhuǎn)移既是為了檢測其是否處在生殖期，又是防止其與其子代幼蟲被混淆的關(guān)鍵措施，必須要及時進行。

2.4.2 身體運動

觀測秀麗隱桿線蟲的身體運動可通過敲擊培養(yǎng)皿，觀察秀麗隱桿線蟲在10sec內(nèi)頭部運動距離是否大于1mm，若大于則秀麗隱桿線蟲處在快速運動期；若小于則處在非快速運動期。

2.4.3 咽部運動

觀測咽部運動時，需在顯微鏡下記錄10sec內(nèi)秀麗隱桿線蟲咽部的收縮次數(shù)，多次測量取平均值。收縮次數(shù)在1～24次為緩慢收縮，大于等于24次為快速收縮，0次為不收縮。

2.5 細化實驗，探究相關(guān)藥物對秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用所處階段

在檢測出相關(guān)藥物對秀麗隱桿線蟲具有抗衰老作用后，可進一步細化實驗以探究相關(guān)藥物的具體作用時期。由于秀麗隱桿線蟲的生命周期分為四個階段，細化實驗時可通過上文敘述的判斷方法區(qū)分秀麗隱桿線蟲所處的階段，具體統(tǒng)計每一階段所處的天數(shù)并與對照組進行對比。

3結(jié)論

1、由上述文章分析可知，秀麗隱桿線蟲廣泛用于藥物篩查的原因主要是秀麗隱桿線蟲固定的細胞數(shù)目，基因與人類同源性較高且易養(yǎng)殖。

固定的細胞數(shù)目有助于減少無關(guān)變量，使實驗結(jié)果更具說服力；由于基因與人類同源性越高的動物往往越難養(yǎng)殖，所以秀麗隱桿線蟲與人類在基因上較高的同源性和其易養(yǎng)殖的特點讓其被廣泛運用于抗衰老藥物的初步篩查。

2、實驗時需充分考慮被篩選藥物在無關(guān)變量方面對實驗結(jié)果的影響。

實驗中除了要減少常規(guī)物理因素帶來的無關(guān)變量對實驗結(jié)果的影響之外，還要注意藥物是否會對培養(yǎng)基，秀麗隱桿線蟲的進食行為產(chǎn)生非藥理性影響。

參考文獻：

[1]楊再昌，楊小生.秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）在藥物篩選中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2009，21（04）：593-598.

[2]Petrascheck M，Ye XL，Buck LB. An antidepressant thatextends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature，2007，450（11）：553-6

[3]劉靜. 黃芪多糖對秀麗隱桿線蟲的延壽作用及其機制研究[D]. 哈爾濱醫(yī)藥大學(xué)，2013.