白景瑞，吳咸中，劉洪斌，李東華，崔麗華，高巧營，宗春暉，張 一

腹腔粘連是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，輕則引起腹部不適、慢性腹痛，重則導(dǎo)致粘連性腸梗阻、女性不孕等不良后果[1]。清熱解毒方和涼血活血方是天津南開醫(yī)院應(yīng)用多年的臨床驗方，對于改善術(shù)后腹腔粘連等并發(fā)癥有良好的治療效果。為進一步探索清熱解毒方和涼血活血方對術(shù)后腹腔粘連的防治機理，我們以腹腔粘連大鼠模型為研究對象，通過多種組織形態(tài)學(xué)方法觀察其療效，并探索其可能機制，為將來的藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 水合氯醛購自天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司。10%中性甲醛溶液、水合氯醛購自天津化學(xué)試劑公司；天狼星紅（Direct Red 80）購于Sigma公司，飽和苦味酸溶液購于南京建成生物工程研究所。甲硝唑片（批號20160819）由天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，頭孢氨芐片（批號20161026）由哈藥集團制藥總廠制劑廠生產(chǎn)，聚乳酸防粘連凝膠（批號20170612）購自石家莊瑞諾生物醫(yī)學(xué)材料有限公司。全自動脫水機LEICA-ASP200S，包埋機LEICA-EG1150H、LEICA-EG1150 C，切片機LEICA-RM2235，攤片機LEICA-H1210，烤片機LEICA-H1220，顯微鏡LEICA-DM4000B，偏光顯微鏡LEIKADM2500P，圖像系統(tǒng)軟件版本（LAS Version 3.7.0），均為德國LEICA公司產(chǎn)品。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG101-A由河南予華儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物 SPF級10周齡健康Wistar大鼠120只，雄性，體重 （260±10）g，由天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供，動物批號SCXK（津）2016-0001。在實驗前，大鼠在SPF級動物室中適應(yīng)1周，給予標(biāo)準動物飼料和水，環(huán)境溫度維持在18～26 ℃，相對濕度30%～70%，明暗交替周期為12/12h。

1.3 方劑構(gòu)成及配制方法 清熱解毒方由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草組成，比例為10∶3∶6∶2。涼血活血方由紅藤、丹皮、赤芍、元胡組成，構(gòu)成比例為4∶3∶3∶2。以上藥物均采用三九現(xiàn)代中藥有限公司提供的免煎顆粒沖劑。實驗前將配方顆?；旌虾?，按藥品說明用沸水將免煎顆粒溶解，配制成每4 mL藥液藥物含量相當(dāng)于6 g生藥藥量。配制后將藥液冷卻至室溫，保存于4 ℃冰箱備用。灌胃前先將藥液恢復(fù)至室溫，并充分混勻后使用。

1.4 腹腔粘連模型制備 按照課題組前期建立的大鼠腹腔粘連模型[2]。實驗動物術(shù)前禁食不禁水12 h。以10%水合氯醛（3 mL/kg體重）腹腔注射麻醉。麻醉滿意后將大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，腹部備皮，經(jīng)安爾碘消毒皮膚后開始手術(shù)：取上腹部正中切口約2 cm長，找到十二指腸，自幽門而下，每隔0.5 cm用小號止血鉗鉗夾腸管，鉗夾時止血鉗與腸管垂直，持續(xù)3秒，共鉗夾9處，而后將腸管納回腹腔，逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組只開腹不致傷。術(shù)后12 h后予自由飲水，24 h后予標(biāo)準飼料，繼續(xù)分籠飼養(yǎng)。

1.5 實驗分組及給藥方法 120只健康雄性Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為6組，每組20只：假手術(shù)組、模型組、抗生素組、聚乳酸組、清熱解毒方組、涼血活血方組。假手術(shù)組及模型組給予4 mL生理鹽水代替。清熱解毒方組、涼血活血方組于手術(shù)后第1天開始灌胃給藥，連續(xù)7天，每天灌胃1次，灌胃量12 mL藥液/公斤體重?？股亟M：口服灌胃，劑量為頭孢氨芐6 mg/100 g+甲硝唑7 mg/100 g，1次/d。聚乳酸組：造模后，將1.5 mL聚乳酸防粘連凝膠均勻涂抹于手術(shù)部位，關(guān)腹。術(shù)后不再給予其他任何治療。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 大鼠生存情況及腹腔粘連大體評價 術(shù)后觀察并記錄大鼠生存情況，于術(shù)后第14 d處死解剖：腹部取“U”形切口開腹，首先檢查腹腔粘連的發(fā)病率。粘連的范圍和強度由兩個非實驗參與人員在雙盲的情況下進行評分，兩種不同的評分系統(tǒng)分別參考Nair和Zühlke的評分標(biāo)準[3]（詳見表1），最后評分取兩次評分的均數(shù)；同時記錄粘連受累器官。

表1 大鼠腹腔粘連大體評價標(biāo)準

1.6.2 組織病理學(xué)評價 大體評價后，取手術(shù)部位及粘連組織標(biāo)本，用0.9%生理鹽水漂洗干凈后，經(jīng)固定、蠟塊包埋、常規(guī)切片等處理，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察其組織病理變化并攝片。

組織病理評分采用盲評法，由兩位病理科醫(yī)師對病理切片進行觀察并評分，評價指標(biāo)包括纖維化、炎癥反應(yīng)和血管增殖情況[4]，見表2。最后結(jié)果取兩次評分的均數(shù)。

表2 腹腔粘連組織學(xué)（HE染色）評價標(biāo)準

1.6.3 粘連部位膠原含量測定 粘連部位Ⅰ、Ⅲ型膠原含量測定采用苦味酸-天狼星紅染色法[5]，經(jīng)偏光顯微鏡分析圖像，每張切片在200倍視野下隨機選取5個視野攝片，圖片采用Image-Pro?Plus v 6.0 For Windows 圖像分析軟件計算粘連組織中I型膠原和Ⅲ型膠原染色表達的面積百分比。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計運算，各組術(shù)后生存情況繪制生存曲線，生存率比較采用壽命表（Life Table）法，粘連評價、膠原分析結(jié)果的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 生存情況分析 造模后14天生存情況比較，清熱解毒方組生存率明顯高于聚乳酸治療對照組（P＜0.05），其余各治療組生存率與聚乳酸治療對照組之間無顯著差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 術(shù)后14天各實驗組動物生存情況

2.2 術(shù)后腹腔粘連大體評價結(jié)果 無論是粘連的范圍還是強度，各治療組粘連評分均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。清熱解毒方組粘連范圍評分高于假手術(shù)組，顯著低于抗生素組、聚乳酸組及涼血活血方組（P＜0.05）；涼血活血方組與抗生素組、聚乳酸組相比無明顯差異（P＞0.05）。清熱解毒方組粘連強度高于假手術(shù)組，低于模型組、抗生素組、聚乳酸組、涼血活血方組（P＜0.05）；模型組、抗生素組、聚乳酸組、涼血活血方組之間兩兩比較粘連強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 粘連部位組織學(xué)評價結(jié)果 纖維化評分：術(shù)后14天時，清熱解毒方組、涼血活血方組、抗生素組均低于模型組（P＜0.05）。清熱解毒方組明顯低于聚乳酸組（P＜0.05），但涼血活血方組與抗生素組、聚乳酸組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。炎癥評分：除聚乳酸組外，各組均低于模型組（P＜0.05）。清熱解毒方組、涼血活血方組、抗生素組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。血管增殖評分：清熱解毒方組、抗生素組血管增殖評分低于模型組、聚乳酸組（P＜0.05），與假手術(shù)組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。涼血活血方組與模型組、聚乳酸組兩兩比較無明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖2 術(shù)后14天各實驗組腹腔粘連大體評分

圖3 術(shù)后14天各實驗組粘連部位組織學(xué)評價結(jié)果（HE染色）

2.4 粘連部位膠原含量分析結(jié)果 各治療組粘連區(qū)域Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量均高于假手術(shù)組而低于模型組（P＜0.05）。清熱解毒方組Ⅰ型膠原的含量與抗生素組、涼血活血方組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），明顯低于聚乳酸組（P＜0.05）。涼血活血方組Ⅰ型膠原的含量與抗生素組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），均低于聚乳酸組（P＜0.05）。清熱解毒方組Ⅲ型膠原的含量與抗生素組無明顯差異（P＞0.05），低于聚乳酸組、涼血活血方組（P＜0.05）。涼血活血方組Ⅲ型膠原的含量低于聚乳酸組，而高于其他3個治療組（P＜0.05），見圖4。

圖4 術(shù)后各組粘連部位膠原含量比較（苦味酸-天狼星紅染色）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為腹腔粘連形成是機體應(yīng)對手術(shù)打擊過度應(yīng)激的結(jié)果[6]。手術(shù)及手術(shù)后炎癥現(xiàn)象引起腹膜損傷，導(dǎo)致手術(shù)部位血流嚴重減少，血管病理性增生，血管滲透性增加，炎癥細胞激增。炎性滲出中激活的纖維蛋白原在兩個相互連接的腹膜漿膜破損面之間，轉(zhuǎn)化成膠狀的纖維蛋白性基質(zhì)[7]。組織型纖溶酶原激活劑（tissue Plasminogen Activators，tPA）介導(dǎo)的纖溶酶原激活能力大大減弱，而腹膜損傷和炎癥引起纖溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activators Inhibiter，PAI）大量產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致機體纖溶能力的下降。沉積的纖維蛋白在術(shù)后早期未被及時降解吸收并持續(xù)存在，形成纖維素性粘連。在巨噬細胞、成纖維細胞等細胞成分以及組織碎片等參與下，纖維素性粘連轉(zhuǎn)化為由成纖維細胞和不同類型的膠原構(gòu)成的纖維束，在兩個腹膜破損面之間形成永久的粘連。

傳統(tǒng)中醫(yī)將腹腔粘連歸類于“癥瘕積聚”的范疇，術(shù)后早期的中醫(yī)辨證為氣滯血瘀，脈絡(luò)閉阻，實熱內(nèi)蘊，以致正氣虧虛，邪實為害[8]。

清熱解毒方、涼血活血方2個中藥治療組術(shù)后14天時動物生存率與抗生素組、模型組均沒有明顯差異。推測其原因可能是十二指腸鉗夾致術(shù)后腹腔粘連動物模型的手術(shù)創(chuàng)傷局限于十二指腸，雖能誘發(fā)腹腔粘連形成，卻不會造成使實驗大鼠致死的膿毒癥，可以有效減少實驗動物的需求數(shù)量[2]。這也是該動物模型的優(yōu)點之一。而聚乳酸組大鼠尸檢時發(fā)現(xiàn)手術(shù)部位腸管缺血嚴重，腸腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量血凝塊。這可能是在抹抗粘連凝膠時，碰觸擠壓等操作對手術(shù)部位造成了二次損傷，加重了腸壁出血壞死，導(dǎo)致本組死亡率明顯高于其余各組。

清熱解毒方有效成分包括多種大黃素、白頭翁皂苷等。細菌學(xué)研究表明：清熱解毒方能抑制多種耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌，尤其對耐藥鮑曼不動桿菌和耐藥銅綠假單胞菌抑菌效果佳[9]。術(shù)后早期應(yīng)用不僅能有效地減輕手術(shù)部位及周圍的炎癥反應(yīng)[10]，還可通過下調(diào)腸道水通道蛋白表達，興奮腸道平滑肌，促進腸蠕動恢復(fù)，減少了手術(shù)部位貼合的時間，促進手術(shù)部位炎性滲出液的吸收[11]，抑制纖維蛋白性基質(zhì)的生成和Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積，減少術(shù)后腹腔粘連形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而有效減輕術(shù)后腹腔粘連的形成。

涼血活血方有效成分包括：丹皮酚、丹皮多糖、延胡索乙素、綠原酸、紅藤總皂苷等。前期研究表明[12]：涼血活血方可改善膿毒癥大鼠模型腸屏障功能，降低血漿內(nèi)毒素水平，減少手術(shù)后腹膜炎癥影響，本研究也證實：涼血活血方術(shù)后抗炎效果與抗生素相當(dāng)。涼血活血方能穩(wěn)定腸微血管內(nèi)皮細胞，減少血管的滲出與內(nèi)皮細胞的分泌，降低血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達，抑制粘連組織內(nèi)毛細血管的新生[13]；提高粘連組織中tPA水平，抑制PAI-1、結(jié)締組織生長因子、成纖維細胞生長因子-10合成，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原含量[12]，從而減少術(shù)后腹腔粘連。

清熱解毒方和涼血活血方均有抗炎作用，以清熱解毒方為優(yōu)；而清熱解毒方對腸道功能的改善，能確切地減少纖維蛋白性基質(zhì)的形成，有效地降低粘連的強度和范圍。涼血活血方對纖溶能力的改善雖能增強纖維蛋白的溶解吸收，但其抗粘連效果遜于清熱解毒方。

清熱解毒方、涼血活血方組對于十二指腸鉗夾引起的術(shù)后腹腔粘連均有良好的防治作用，且清熱解毒方優(yōu)于涼血活血方?？拐尺B機理與中藥的抗炎作用，促進腸蠕動恢復(fù)，減輕術(shù)后炎性滲出，促進纖維蛋白基質(zhì)的溶解吸收，抑制膠原的沉積和機化有關(guān)。