石菡 李艷芳 袁媛 賈志華 紀(jì)風(fēng)兵

中圖分類號 R511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3112-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.18

摘 要 目的：研究HLA-DP基因多態(tài)性與丙型肝炎病毒（HCV）患者抗病毒治療免疫應(yīng)答的相關(guān)性。方法：選取2013年5月-2017年8月于我院就診的HCV漢族患者106例，所有患者均接受為期48周的聚乙二醇化干擾素α（PEG IFNα）+利巴韋林（RBV）聯(lián)合治療，并于停藥后接受為期24周的隨訪。記錄其年齡、體質(zhì)量、HCV-RNA基線水平等一般資料，并采用Taqman-MGB熒光探針實時定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測其HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點的分型。根據(jù)治療結(jié)局將患者分為持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組（SVR）和未持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組（N-SVR），采用Logistic回歸模型對影響HCV患者抗病毒治療免疫應(yīng)答的相關(guān)因素（性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、HCV-RNA基線水平以及基因多態(tài)性）進(jìn)行單因素和多因素分析。結(jié)果：106例患者中，rs3077位點CC、CT、TT型頻率分別為40.6%、35.8%、23.6%，rs2395309位點GG、GA、AA型頻率分別為50.0%、39.6%、10.4%，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P>0.05）。SVR組患者80例，N-SVR組患者26例;SVR組患者的年齡、rs3077位點CT、TT型以及rs2395309位點GA、AA型比例均顯著低于N-SVR組，rs3077位點CC型以及rs2395309位點GG型比例均顯著高于N-SVR組（P<0.05）;而兩組患者的性別、體質(zhì)量指數(shù)、HCV-RNA基線水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。單因素、多因素分析結(jié)果顯示，患者性別，體質(zhì)量指數(shù)，HCV-RNA基線水平，rs3077位點CC型、rs2395309位點GG型與其抗病毒治療免疫應(yīng)答不顯著相關(guān)（P>0.05），而年齡、rs3077位點CT和TT型、rs2395309位點GA和AA型與其抗病毒治療免疫應(yīng)答顯著相關(guān)[比值比（OR）分別為1.135、1.766、1.283、1.218、1.103，95%置信區(qū)間（CI）分別為（1.017，1.267）、（1.007，3.100）、（1.038，1.585）、（1.011，1.467）、（1.038，1.172），P<0.05]。結(jié)論：年齡以及HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點多態(tài)性與HCV漢族患者PEG IFNα+RBV抗病毒治療免疫應(yīng)答相關(guān)，其中低齡患者可能獲得較高的抗病毒免疫應(yīng)答率，而T、A突變等位基因攜帶者則可能獲得更低的抗病毒免疫應(yīng)答率。

關(guān)鍵詞 丙型肝炎病毒;漢族;HLA-DP基因;基因多態(tài)性;rs3077;rs2395309;抗病毒治療免疫應(yīng)答;相關(guān)性

Correlation Analysis of HLA-DP Gene Polymorphisms with Immune Response to Antiviral Treatment for HCV Patients

SHI Han，LI Yanfang，YUAN Yuan，JIA Zhihua，JI Fengbing（Dept. of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the correlation of HLA-DP gene polymorphisms with the immune response to antiviral treatment for hepatitis C virus （HCV） patients. METHODS： A total of 106 HCV Han-nationality patients were collected from our hospital during May 2013 to Aug 2017. All patients received PEG IFNα+ribavirin （RBV） for 48 weeks， and then 24 week follow-up after drug withdrawal. Age， body weight and baseline level of HCV-RNA were recorded. The typing of rs3077 and rs2395309 site of HLA-DP gene were detected by RT-qPCR with Taqman-MGB fluorescent probe. According to treatment outcome， the patients were divided into two groups such as sustained viral response （SVR） group and no-sustained viral response （N-SVR） group. Univariate and multivariate analysis were performed for influential factors （gender， age， body weight index， HCV-RNA baseline level， gene polymorphisms） of immune response to antiviral treatment for HCV patients with Logistic regression model. RESULTS： Among 106 patients， the frequencies of CC， CT and TT genotype at rs3077 site were 40.6%， 35.8% and 23.6%; those of GG， GA and AA genotype at rs2395309 site were 50.0%， 39.6%， 10.4%， respectively， which were in line with Hardy-Weinberg genetic balance （P>0.05）. Totally 80 HCV patients were obtained in SVR group， and 26 HCV patients in N-SVR group. The patients age， the proportion of CT and TT genotype of rs3077 site and GA and AA genotype of rs2395309 site in SVR group were significantly lower than N-SVR group. The proportion of CC genotype at rs3077 site and GG genotype at rs2395309 site were significantly higher than N-SVR group （P<0.05）. There was no statistical significance in gender， body weight index or HCV-RNA baseline level between 2 groups （P>0.05）. Univariate and multivariate analysis showed that gender， body mass index， HCV-RNA baseline level， CC genotype at rs3077 site and GG genotype at rs2395309 site were not related to the immune response to antiviral treatment （P>0.05）. Age， CT and TT genotype at rs3077 site， GA and AA genotype at rs2395309 site were associated with the immune response to antiviral therapy [OR were 1.135， 1.766， 1.283， 1.218， 1.103， 95%CI were （1.017，1.267）， （1.007，3.100）， （1.038，1.585）， （1.011，1.467）， （1.038，1.172）， respectively， P<0.05]. CONCLUSIONS： Age and the polymorphisms of HLA-DP gene at rs3077 and rs2395309 site are related to immune response to PEG IFNα+RBV antiviral treatment for HCV Han-nationality patients. Young patients may have higher antiviral immune response rate， while carriers with T and A mutation alleles may have lower antiviral immune response rate.

KEYWORDS ? Hepatitis C virus; Han nationality; HLA-DP gene; Gene polymorphisms; rs3077; rs2395309; Antiviral treatment immune response; Correlation

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是肝硬化、肝細(xì)胞癌（HCC）、肝臟移植的主要病因。據(jù)統(tǒng)計，2015年全球約有七千萬人感染HCV，其中我國和印度的感染率較高[1]。目前，聚乙二醇化干擾素α（PEG IFNα）聯(lián)合利巴韋林（RBV）是治療HCV感染的首選方案[2]。然而，由于病毒基因差異、環(huán)境惡化、患者個體及遺傳差異等因素導(dǎo)致部分接受抗病毒治療的患者無法獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR）[3]。有研究報道，攜帶特定基因型（如IL-28B基因 rs12979860位點CC型、rs8099917位點TT型）的患者在接受抗病毒治療時具有更高的HCV清除率，且最終可獲得較高的SVR[4]。同時，近年研究指出，HLA- DP基因多態(tài)性與HCV感染及患者轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[5]。為進(jìn)一步提高HCV的治療有效率，本研究系統(tǒng)分析了HCV患者HLA-DP基因多態(tài)性與其抗病毒治療免疫應(yīng)答的相關(guān)性，以期為HCV的精準(zhǔn)治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年5月-2017年8月于我院確診并接受PEG IFNα+RBV抗病毒治療的HCV患者106例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[6]診斷為HCV的漢族患者;（2）HCV-RNA（即病毒載量）≥3 logIU/mL;（3）臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期或哺乳期婦女;（2）合并乙型肝炎病毒（HBV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者;（3）其他類型病毒感染者;（4）自身免疫性疾病患者;（5）精神疾病患者;（6）病情未能控制的癲癇患者;（7）酗酒或吸毒者;（8）失代償期肝硬化者;（9）心臟病患者;（10）治療前粒細(xì)胞<1.0×109 L-1、血小板<50×109 L-1、血紅蛋白<80 g/L者;（11）器官移植急性期（肝移植除外）者;（12）腎功能不全者。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均對本研究知情并簽署了知情同意書。記錄所有患者入院時的一般資料（如性別、年齡、體質(zhì)量等）和臨床資料（有無基礎(chǔ)疾病、病毒載量等）。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 所有患者均接受聚乙二醇干擾素α-2a注射液（瑞士Roche Registration Ltd.，注冊證號：S20120049，規(guī)格：180 μg/0.5 mL）180 μg/次，每周1次，皮下注射，并按如下方案調(diào)整劑量：當(dāng)患者中性粒細(xì)胞為0.5×109～0.75×109 L-1時，該藥用量降至135或90 μg/次，每周1次;當(dāng)患者中性粒細(xì)胞持續(xù)下降且低于0.5×109 L-1時，停用該藥1～2次，并聯(lián)合使用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液[哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字S20050047，規(guī)格：18 000 000 IU（300 μg）/支]100 μg/m2，每日1次，皮下注射，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞至0.75×109 L-1后再繼續(xù)干擾素治療。在此基礎(chǔ)上，所有患者均口服利巴韋林片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20056469，規(guī)格：50 mg）400 mg，每日2次。所有患者均連續(xù)治療48周，并于停藥后接受為期24周的隨訪。

1.2.2 血清HCV抗體以及病毒載量檢測 分別于治療前、治療中及治療結(jié)束后24周（即第0、4、12、24、48、72周，下同）抽取患者靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-70 ℃保存，備用。使用酶聯(lián)免疫吸附法以WM 1000型酶聯(lián)免疫檢測儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）檢測患者血清HCV抗體;使用熒光探針法以7900HT型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司，下同）定量測定HCV-RNA水平。所用HCV抗體檢測試劑盒、HCV-RNA檢測試劑盒分別由杭州隆基生物技術(shù)有限公司、湖南圣湘生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按照其說明書操作。

1.2.3 HLA-DP基因分型檢測 采用Taqman-MGB熒光探針實時定量PCR法以7900HT型實時熒光定量PCR儀對HLA-DP基因rs3077和rs2395309兩個位點的分型進(jìn)行擴(kuò)增，探針和引物序列如表1所示（表中，“FAM”“HEX”分別為6-羧基熒光素和六氯-6-甲基熒光素探針5′端熒光基團(tuán)，“MGB”為小溝結(jié)合探針3′端熒光猝滅基團(tuán)，“P-G/A/C/T”為磷酸化堿基對）。反應(yīng)體系（總體積5 μL）：2×PCR MaterMix 2.5 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL，20 pmol/μL上、下游引物各0.225 μL，10 pmol/μL探針0.125 μL，用ddH2O加至5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環(huán);72 ℃再延伸5 min。運用7900HT型實時熒光定量PCR儀和配套SDS 2.3軟件對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)熒光信號確定基因型，當(dāng)含有FAM或HEX的探針與待測序列互補(bǔ)時，F(xiàn)AM或HEX的熒光基團(tuán)被游離，儀器檢測到熒光信號，其中FAM熒光信號表示含C、G等位基因，HEX熒光信號表示含A、T等位基因。當(dāng)僅有FAM信號時，代表純合子CC或GG;當(dāng)僅有HEX信號時，代表純合子AA或TT;當(dāng)FAM和HEX信號同時增強(qiáng)時，代表雜合子CT或GA。

1.2.4 其他指標(biāo) 分別于第0、4、12、24、48、72周對患者血常規(guī)、血清肌酐、磷酸肌酐、肝功能、甲胎蛋白等實驗室指標(biāo)進(jìn)行評測。

1.2.5 療效評估 （1）快速病毒學(xué)應(yīng)答（RVR）：治療4周內(nèi)，未檢測到HCV-RNA;（2）早期病毒學(xué)應(yīng)答（EVR）：治療12周時，HCV-RNA水平低于最低檢測限（3 logIU/mL，下同）或降低2個數(shù)量級以上;（3）治療結(jié)束病毒學(xué)應(yīng)答（ETVR）：治療結(jié)束時，HCV-RNA水平低于最低檢測限;（4）SVR：治療結(jié)束至隨訪24周內(nèi)，HCV-RNA水平低于最低檢測限;（5）復(fù)發(fā)（Relapse）：有ETVR，但停藥后HCV-RNA檢測為陽性;（6）無應(yīng)答（NR）：無EVR、ETVR;（7）未持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（N-SVR）：將復(fù)發(fā)和NR統(tǒng)稱為N-SVR[6]。根據(jù)治療結(jié)局（即末次隨訪時的療效）將患者分為SVR組和N-SVR組。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗;計量資料以x±s表示，組間比較采用成組t檢驗。采用Logistic回歸模型對影響患者抗病毒治療免疫應(yīng)答的相關(guān)因素進(jìn)行單因素和多因素分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

106例患者均無酗酒史，其中男性62例、女性44例，平均年齡（42.33±14.51）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（23.00±2.23）kg/m2，HCV-RNA基線水平（5.56±0.93）logIU/mL。

2.2 患者Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果

HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點基因型頻率的觀察值與理論值吻合良好，其分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P>0.05），表明所選樣本具有人群代表性，詳見表2。

2.3 SVR和N-SVR組患者基本資料比較結(jié)果

106例HCV患者均完成了48周的抗病毒治療和治療后為期24周的隨訪，其中有80例患者獲得SVR（即SVR組），26例患者未獲得SVR（即N-SVR組）?；€資料比較結(jié)果顯示，兩組患者的性別、BMI、HCV-RNA基線水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;而SVR組患者的年齡顯著低于N-SVR組，且兩組患者HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點各基因型患者比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中SVR組患者rs3077位點CT、TT型以及rs2395309位點GA、AA型患者比例均顯著低于N-SVR組，而CC型和GG型患者比例均顯著高于N-SVR組（P<0.05），詳見表3。

2.4 影響HCV患者抗病毒治療免疫應(yīng)答的單因素和多因素分析結(jié)果

80例獲得SVR患者的單因素和多因素分析結(jié)果見表4、表5。其中，患者性別、BMI、HCV-RNA基線水平、rs3077位點CC型、rs2395309位點GG型與其抗病毒治療免疫應(yīng)答不顯著相關(guān)（P>0.05），而年齡、rs3077位點CT、TT型以及rs2395309位點GA、AA型與其抗病毒治療免疫應(yīng)答顯著相關(guān)（P<0.05）。

3 討論

HCV為全球流行性疾病，每年感染率約為1.0%，且易感人群不分種族、年齡、性別[1]。HCV主要由血制品、輸血和單采血漿還輸血細(xì)胞等途徑經(jīng)破損黏膜和皮膚傳播，感染隱匿，大多數(shù)患者尚無明顯癥狀就已被感染[6]。HCV感染進(jìn)一步可能發(fā)展為失代償期肝硬化、HCC和肝衰竭，嚴(yán)重威脅人群健康。抗病毒治療是清除HCV的首選治療手段，其中PEG IFNα聯(lián)合RBV為目前臨床最常用的治療方案[7]。盡管經(jīng)PEG IFNα+RBV抗病毒治療后，約有50%～80%的患者能獲得SVR，然而有研究指出，HCV抗病毒治療免疫應(yīng)答受多種因素的影響，低齡（青年）、女性、白種人群HCV患者可獲得較高的SVR率[8-10]。

基因多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時或經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性，是產(chǎn)生個體差異的重要基礎(chǔ)?；蚨鄳B(tài)性一方面可能與遺傳病病因明顯關(guān)聯(lián)，另一方面可能與直接導(dǎo)致疾病的基因密切相關(guān)，通過對隨機(jī)選取健康組和病例組某些特定基因位點的等位基因發(fā)生頻率進(jìn)行比較的關(guān)聯(lián)分析法是目前常用的基因多態(tài)性研究方法之一[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，位于人19號染色體的IFNL4基因具有5個外顯子和4個內(nèi)含子，其中位于第1外顯子上的rs368234815位點與HCV患者的免疫應(yīng)答有關(guān)，相較于非TT/TT型攜帶者，TT/TT型患者可獲得更高的SVR[12]。除該多態(tài)性位點外，韋娟等[13]發(fā)現(xiàn)HLA-DP基因的多態(tài)性與HCV感染轉(zhuǎn)歸相關(guān)。人類白細(xì)胞抗原DP（HLA-DP）蛋白在介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞免疫過程中起到抗原信號傳遞的作用，可調(diào)控病原體免疫反應(yīng)。其中，單核苷酸rs3077位點與HLA-DP蛋白a鏈的編碼有關(guān)，當(dāng)野生CC型發(fā)生突變后，其編碼的HLA-DP蛋白活性將明顯下降[14];而rs2395309位于HLA-DP基因3′非編碼區(qū)，當(dāng)野生GG型發(fā)生突變后，將影響靶基因mRNA 3′端的互補(bǔ)匹配，從而改變RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的穩(wěn)定性，使下游HLA-Ⅱ類抗原的表達(dá)受到影響，最終影響患者抗病毒免疫功能;與上述位點野生型攜帶者相比，突變型攜帶者自身病毒清除能力有所降低，病毒感染風(fēng)險將有所增高[15]?；诖耍狙芯肯到y(tǒng)分析了HLA-DP基因多態(tài)性對HCV患者PEG IFNα+RBV抗病毒治療免疫應(yīng)答的影響。

本研究以106例HCV患者為研究對象，其經(jīng)PEG IFNα+RBV抗病毒治療后，有80例（75.5%）獲得SVR，26例（24.5%）未獲得SVR。筆者分析、比較SVR組和N-SVR組患者的基線資料發(fā)現(xiàn)，兩者在性別、BMI、HCV-RNA基線水平等方面均無顯著差異，而SVR組患者的平均年齡顯著低于N-SVR組。此外，運用Taqman-MGB熒光探針實時定量PCR法對兩組患者HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點的分型進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，SVR組和N-SVR患者HLA-DP基因上述兩個位點的基因型頻率均存在顯著差異。這提示患者年齡、HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點多態(tài)性可能與HCV患者抗病毒治療免疫應(yīng)答有關(guān)。

基于現(xiàn)有文獻(xiàn)所述，低齡、女性、白種人群HCV患者可能獲得更高SVR率，且HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點多態(tài)性可能影響HCV患者的轉(zhuǎn)歸[8-10， 14-15]，故本研究在基線資料比較的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對可能影響HCV患者抗病毒治療免疫應(yīng)答的因素進(jìn)行了Logistic單因素、多因素分析。結(jié)果顯示，年齡[OR=1.135，95%CI（1.017，1.267）]、HLA-DP基因rs3077位點CT、TT型[OR分別為1.766、1.283，95%CI分別為（1.007，3.100）、（1.038，1.585）]以及rs2395309位點GA、AA型[OR分別為1.218、1.103，95%CI分別為（1.011，1.467）、（1.038，1.172）]均為HCV患者抗病毒治療免疫應(yīng)答的獨立危險因素（P<0.05）。

李劍萍等[16]對接受PEG IFNα+RBV抗病毒治療的HCV患者療效的影響因素進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)患者年齡與其治療后是否能獲得SVR密切相關(guān)，且低齡者的SVR獲得率顯著高于高齡患者（P=0.001），與本研究結(jié)果相似。分析其原因，可能為HCV患者年齡越小，其疾病慢性化概率越低;反之年齡越大，則慢性化概率越高，疾病進(jìn)展的風(fēng)險也隨之增加;此外，高齡患者在感染時通常伴有其他基礎(chǔ)疾病，加之自身機(jī)能退化、外周血中免疫細(xì)胞（如CD4+T細(xì)胞、樹突狀淋巴細(xì)胞等）數(shù)量減少、機(jī)體耐受力減弱，使得抗病毒治療藥物的使用劑量和療程受到一定限制，最終影響了抗病毒治療的效果[17]。除年齡之外，本研究亦發(fā)現(xiàn)HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點的多態(tài)性與患者的免疫應(yīng)答相關(guān)，其中rs3077位點TT、TC型以及rs2395309位點GA、AA型均可增加個體感染HCV的風(fēng)險，與韋娟等[13]研究結(jié)果基本一致。該研究還指出，HLA-DP基因上述位點多態(tài)性與HCV感染風(fēng)險和自身清除有關(guān)，但其在感染轉(zhuǎn)歸中的具體機(jī)制尚不明確，有待對其分子生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果提示，HCV患者在接受抗病毒治療之前，可根據(jù)HLA-DP基因型進(jìn)行個體化治療，以避免醫(yī)療資源浪費并提高抗HCV治療效果、改善患者預(yù)后。

綜上所述，年齡以及HLA-DP基因rs3077、rs2395309位點多態(tài)性與HCV漢族患者PEG IFNα+RBV抗病毒治療免疫應(yīng)答相關(guān)，低齡患者可能獲得較高的抗病毒免疫應(yīng)答率，而T、A突變等位基因攜帶者則可能獲得更低的抗病毒免疫應(yīng)答率。但由于HLA-DP基因在HCV感染及病情進(jìn)展中的具體機(jī)制尚不清楚，且本研究樣本量較小、類型單一，故上述結(jié)論仍需具多樣性的大樣本研究予以驗證。

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（收稿日期：2018-12-14 修回日期：2019-09-08）

（編輯：張元媛）