張微 ，岳麗玲 ，張延勇 ，韓翠翠 ，徐天嬌 ，朱文斌 ，劉立琨

1.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

原鈣黏蛋白 10（protocadherin 10，PCDH10）是原鈣黏基因家族的新成員，在細胞間粘附、分化、信號傳遞以及細胞周期信號調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。近年研究揭示 PCDH10 在胃癌[1]、肺癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]、結(jié)腸直腸癌[5]等腫瘤組織中表達下調(diào)或缺失，而DNA啟動子區(qū)的甲基化修飾對其表達產(chǎn)生抑制作用。體外過表達PCDH10基因或者DNA去甲基化處理均能顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡，這為腫瘤治療提供新的思路。該研究于2018年6—11月間采用重組慢病毒技術(shù)成功構(gòu)建PCDH10基因過表達載體，并實現(xiàn)了其在人乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達，為深入研究PCDH10在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人胚腎HEK293T細胞購自中科院上海細胞庫；L-15培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Hyclone公司；pLVEF1α-GFP-Puro載體系統(tǒng)和RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑為蘇州吉瑪基因股份有限公司產(chǎn)品；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒購自Takara公司；Transcript One-step gDNA Removal and Sythesis SuperMix購自全式金公司；質(zhì)粒大提試劑盒購自QIAGEN公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購自北京康為世紀公司；兔抗人PCDH10多克隆抗體購自Proteintech公司；嘌呤霉素購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 PCDH10慢病毒表達載體構(gòu)建 從GeneBank中獲得人PCDH10的mRNA序列（NM_020815.2），借助Primer 5.0軟件設(shè)計基因特異性引物，上游和下游分別引入Not I和BamH I酶切位點。PCDH10上游引物：5'-GCGGCCGCATGATTGTGCTATTATGTTTGC-3'，下游引物：5'-GGATCCCTAGGCTTTCT GATGGA-3'。測序鑒定PCR產(chǎn)物。用Not I/BamH I酶切得到目的片段，膠回收后與線性化的pLV-EF1α-GFP-Puro載體連接，構(gòu)建得到pLV-PCDH10表達載體。

1.2.2 慢病毒的包裝及滴度測定 取對數(shù)生長期的HEK293T細胞按 1×106/孔接種于六孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%時，將pLVPCDH10 載體與包裝質(zhì)粒 pGAG/Pol、pRev、pSV-G 用RNAi-Mate試劑共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，6 h后吸棄轉(zhuǎn)染液，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集上清液，4℃4 000 g離心10 min后過濾收集上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將HEK293T細胞以8×103/孔的密度接種于 96孔板，每孔 100 μL，培養(yǎng) 24 h。 將 10 μL 病毒液加入90 μL的無血清培養(yǎng)基中，梯度稀釋測定慢病毒滴度。吸棄96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL梯度稀釋的病毒液，并設(shè)立空白對照組，24 h后每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。熒光倒置顯微鏡下計數(shù)表達綠色熒光的細胞數(shù)，并結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.2.3 穩(wěn)定過表達PCDH10細胞系的建立 將人乳腺癌 MDA-MB-231細胞以 5×104/孔的密度接種于24孔板培養(yǎng)，細胞融合度達到80%以上時進行病毒感染。以預實驗得到的重組慢病毒的最佳MOL值100 侵染 MDA-MB-231，并加入聚凝胺（polybrene，終濃度為5 μg/mL）培養(yǎng)12 h后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。繼續(xù)用嘌呤霉素（0.5 μg/mL）篩選 1周，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLV-PCDH10的MDA-MB-231細胞株。

1.2.4 RT-PCR方法檢測PCDH10基因表達 收集重組慢病毒感染組和對照組細胞，TRIzol提取總RNA。取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，PCDH10上游引物：5'-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3'， 下游引物 ：5'-GTCTGTCAACTA GATAGCTG-3'，擴增片段為 219 bp；β-actin作為內(nèi)參， 上游引物：5'-GTGGACATC CGCAAAGAC-3'， 下游引物 ：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'，擴增片段為303 bp。PCR反應條件：94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min 循環(huán) 35 次。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.5 Westernblot檢測PCDH10蛋白表達 收集重組慢病毒感染組和對照組細胞,提取總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。每組取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min后，二抗室溫孵育2 h，ECL顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)成像。以GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗均重復3次，數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料（±s）表示，使用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建pLV-PCDH10重組載體

選取重組載體的陽性克隆進行測序，測序結(jié)果與GeneBank中PCDH10序列比對驗證，表明插入片段正確無誤（圖1），說明pLV-PCDH10表達載體構(gòu)建成功。

圖1 重組慢病毒載體pLV-PCDH10的測序結(jié)果

2.2 重組慢病毒的滴度測定

將慢病毒質(zhì)粒 pLV-EF1α-GFP-Puro和 pLVPCDH10 與包裝質(zhì)粒 GAG/Pol、pRev、pSV-G 共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞72 h后，熒光顯微鏡下可見明顯的熒光 （圖2），提示轉(zhuǎn)染成功。計算病毒滴度分別為2×108TU/mL 和 5×108TU/mL。

圖2 重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后觀察綠色熒光蛋白表達（×40）

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后PCDH10基因、蛋白表達上調(diào)

以轉(zhuǎn)染空載體的MDA-MB-231為對照組，轉(zhuǎn)染pLV-PCDH10載體的MDA-MB-231為實驗組。RTPCR結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組中PCDH10的mRNA表達水平明顯上調(diào)（圖3A）。Western blot蛋白條帶及灰度值分析顯示，實驗組中PCDH10蛋白表達（0.69±0.01）高于對照組（0.12±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖 3B）。進一步證實 PCDH10重組慢病毒載體構(gòu)建成功，能在MDA-MB-231細胞中穩(wěn)定表達。

圖3 對照組與實驗組中PCDH10蛋白的表達水平

3 討論

PCDH10基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，已有研究證實，其在多種人類惡性腫瘤中低表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)胃癌病灶內(nèi)PCDH10的mRNA表達量顯著低于癌旁病灶，低表達的PCDH10能夠影響蛋白酶表達相關(guān)基因 Vav2、Vav3、CatB、MMP9、TIMP1、TIMP2以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因ZEB1、Twist1、Vimentin、RASAL2、E-cadherin 的表達， 進而促進胃癌細胞浸潤性生長及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[1]。PCDH10在非小細胞肺癌組織中低表達，過表達PCDH10基因可通過誘導細胞發(fā)生G1期阻滯及促進凋亡而抑制A549細胞的增殖能力；通過下調(diào)Slug基因的mRNA和蛋白表達抑制細胞的遷移和侵襲[2]。張微等人[3]發(fā)現(xiàn)PCDH10在乳腺癌MDA-MB-231細胞中表達缺失，5-Aza-CdR去甲基化處理能夠誘導PCDH10重新表達，并通過阻滯NF-κB p65的活化，下調(diào)MMP2和MMP9表達而抑制MDA-MB-231細胞的侵襲遷移能力。這些結(jié)果均提示，PCDH10低表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但其如何參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程仍需進一步研究。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒（human immunodeficienct virus 1，HIV-1）為基礎(chǔ)改建而來的基因載體[6]，對分裂和非分裂細胞均具有感染力，可以將目的基因有效地整合到宿主細胞的基因組上，實現(xiàn)目的基因長期穩(wěn)定的表達，轉(zhuǎn)染效率高[7]，且可攜帶9 000 bp的目的基因，不產(chǎn)生化學轉(zhuǎn)染等引起的細胞損傷和免疫反應，具有較好的生物安全性[8]。目前，通過慢病毒載體介導基因過表達，獲得穩(wěn)定表達目的基因的細胞株，進而研究基因功能的方法已被廣泛應用[9]。閆丹等[10]通過構(gòu)建IL-35的慢病毒表達載體，并將其轉(zhuǎn)染A549細胞，獲得了過表達IL-35的A549穩(wěn)定細胞株。該研究利用PCR法擴增PCDH10全長片段，通過連接Not I和BamH I雙酶切的PCDH10基因和載體pLV-EF1α-GFP-Puro，繼而經(jīng)包裝病毒，獲得高滴度（5×108TU/mL）的重組慢病毒質(zhì)粒 pLV-PCDH10。用病毒液感染MDA-MB-231細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定過表達PCDH10基因的MDA-MB-231細胞株。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示PCDH10的mRNA表達和蛋白表達均較對照組高表達。

以上結(jié)果顯示該研究成功獲得了穩(wěn)定過表達PCDH10基因的MDA-MB-231細胞株，為深入探索PCDH10基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及臨床治療中的功能提供了實驗支持。