花紅兵，錢福文，鄭煒貞

(1.江蘇省如東縣中醫(yī)院，江蘇 226400；2.四川省廣元市中醫(yī)院，廣元 628000；3.江蘇省南通市第一人民醫(yī)院，南通 226001)

缺血性卒中是世界范圍內(nèi)一種嚴(yán)重危害人類身體健康的心腦血管疾病，具有較高的致死率和致殘率，給患者造成極高的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且其發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)[1-3]。缺血性卒中的病理基礎(chǔ)是各種原因造成的局部腦供血?jiǎng)用}狹窄或阻塞，最終引起其供血部位腦組織的缺血缺氧性壞死，根據(jù)病變發(fā)生的腦組織部位可伴有不同的神經(jīng)功能缺損癥狀[4-6]。根據(jù)最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國目前約有700萬腦梗死患者，其中約70%患者伴有較嚴(yán)重的身體功能障礙[7]。雖然患病人數(shù)眾多，但是現(xiàn)今腦梗死疾病仍缺乏有效的治療手段，組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)仍是目前唯一被美國FDA認(rèn)可的治療藥物。但是其非常嚴(yán)格的4.5 h治療窗給其臨床應(yīng)用帶來了極大的限制。因此尋找新的與缺血性卒中有關(guān)的治療策略是當(dāng)今生命醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)極大的挑戰(zhàn)及任務(wù)。最新的研究表明針灸治療能夠通過改變機(jī)體的血流速度、血管活性以及整體的循環(huán)狀態(tài)而有效地改善突發(fā)腦血管意外患者的預(yù)后[8-9]。但現(xiàn)有的研究尚未闡明針灸通督法在缺血性卒中治療中的作用機(jī)制及與預(yù)后的關(guān)系。CD40/CD40L是一對(duì)能夠介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的共刺激分子，參與調(diào)控缺血性卒中、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病等眾多炎性疾病的病理過程[10-14]。本研究給予缺血性卒中患者針灸通督法聯(lián)合常規(guī)藥物治療，通過與常規(guī)藥物治療相比較，觀察其是否能更有效地治療缺血性卒中，并進(jìn)一步分析其治療作用機(jī)制是否與對(duì)CD40/CD40L系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

1 臨床資料

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年1月在江蘇省如東縣中醫(yī)院及四川省廣元市中醫(yī)院針灸腦病科收入的急性缺血性卒中患者100例。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為藥物組和針?biāo)幗M。兩組患者性別、年齡、血壓等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[15]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合缺血性卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)；②發(fā)病超過24 h并經(jīng)CT/MRI檢查符合缺血性卒中的影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③癥狀及體征符合中風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；④年齡＜80歲；⑤生命體征平穩(wěn)，家屬或患者簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄已進(jìn)展到慢性完全性閉塞；②大面積腦梗死導(dǎo)致的嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙；③對(duì)肝素、阿司匹林或其他抗血小板聚集類藥物禁忌者；④已存在實(shí)質(zhì)性腦損傷、腦腫瘤、腦寄生蟲病患者；⑤伴有顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，且不能提前或同時(shí)處理者；⑥嚴(yán)重心、肝、腎疾病者；⑦患者或患者家屬不同意治療。

2 治療方法

2.1 藥物組

患者入院后口服阿司匹林，每次100 mg，每日1次。連續(xù)服藥14 d為1個(gè)療程。

2.2 針?biāo)幗M

在對(duì)照組基礎(chǔ)上采用針灸通督法。主穴取患者百會(huì)、大椎、風(fēng)池、曲池、合谷、足三里、三陰交，配穴取太沖、太溪、豐隆、外關(guān)、間使、氣海、血海，局部皮膚消毒后，選用0.30 mm×40 mm無菌針灸針對(duì)上述穴位進(jìn)行針刺，得氣后留針30 min。每日治療1次，以14 d為1個(gè)療程。

3 治療效果

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)提取

EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血5 mL，與5 mL PBS混勻后加入預(yù)先已加入5 mL Ficoll分離液的15 mL離心管中，2000 r/min離心30 min；用毛細(xì)吸管小心吸取白膜層細(xì)胞，置于另一15 mL離心管中，加入2～3倍體積的PBS，顛倒混勻，2000 r/min離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time)PCR

采用Real-time PCR法檢測(cè)PBMCs中的CD40 mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用Prime Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下，CD40：正向5’-GCAGGCACAAACAAGACTGA-3’，逆向5’-TCGTCGGG AAAATTGATC TC-3’；GAPDH(內(nèi)參)：正向5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，逆向5’-AG GTC CACC A CTGACACGTT-3’。

PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃ 10 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)，在延伸的過程中搜集熒光信號(hào)。于每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無cDNA的陰性對(duì)照，將PCR產(chǎn)物做熔解曲線，以證實(shí)以上PCR反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好。用7500 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)2-ΔΔCt值以比較各組mRNA的表達(dá)。

3.1.3 Western blot

準(zhǔn)備PBMCs蛋白樣品，98℃變性5 min，冰上冷卻，SDS-PAGE電泳后使用半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。一抗4℃孵育16～18 h，TBST洗滌10 min，3次。二抗室溫(20～25℃)孵育1 h，TBST洗滌10 min，3次。加入高靈敏的LunimataTM Crescendo發(fā)光劑至PVDF膜，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

3.1.4 血漿細(xì)胞因子sCD40L、IL-6、IL-1β的檢測(cè)

抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，3000 r/min離心10 min，分離血漿，采用ELISA法檢測(cè)血漿中IL-6、IL-1β的水平。試劑盒購自北京熱景生物技術(shù)有限公司，具體步驟嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

3.1.5 不良事件

治療后檢查TCD、CTA或DSA了解腦血管狹窄病變情況，并由專職護(hù)理人員經(jīng)過神經(jīng)內(nèi)科?？漆t(yī)生培訓(xùn)后對(duì)患者進(jìn)行隨訪(對(duì)于不能來院的患者進(jìn)行電話隨訪)，對(duì)術(shù)后3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的偏癱、黑矇、短暫性腦缺血發(fā)作(transientischemic attack，TIA)或死亡的患者進(jìn)行登記，以上均標(biāo)記為不良事件。

3.2 療效標(biāo)準(zhǔn)[16]

治療后3個(gè)月復(fù)查，通過NIHSS評(píng)分確定療效。

顯效：臨床癥狀好轉(zhuǎn)或消失，NIHSS評(píng)分較治療前減少≥70%。

有效：臨床癥狀改善，NIHSS評(píng)分較治療前減少40%～69%。

無效：未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 治療結(jié)果

3.4.1 兩組治療前后PBMCs中CD40 mRNA和蛋白表達(dá)的變化

分離并收集兩組患者治療前及治療后1周的外周血PBMCs，運(yùn)用Real-time PCR及Western blot對(duì)PBMCs上CD40表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組患者治療后PBMCs中CD40 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.05，見表2、圖1)，且相對(duì)于藥物組，針?biāo)幗MPBMCs中CD40 mRNA及蛋白的表達(dá)水平下降更為顯著(P＜0.05)。

表2 兩組治療前后CD40 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化 (±s)

表2 兩組治療前后CD40 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化 (±s)

注：與同組治療前比較1)P＜0.05

項(xiàng)目 藥物組 針?biāo)幗M治療前 治療后 治療前 治療后CD40 mRNA 2.21±0.37 1.08±0.241) 2.67±0.32 1.15±0.221)CD40 蛋白 2.16±0.18 1.06±0.181) 3.35±0.29 1.12±0.201)

圖1 兩組治療前后PBMCs中CD40蛋白表達(dá)的變化

3.4.2 兩組治療前后sCD40L、IL-1β、IL-6水平比較

兩組患者治療后血漿sCD40L、IL-1β、IL-6水平均明顯降低(P＜0.05)，且相對(duì)于藥物組，針?biāo)幗M患者血漿sCD40L及IL-6的水平下降更為顯著(P＜0.05)。詳見表3。

表3 兩組治療前后sCD40L、lL-1β、lL-6水平比較 (±s)

表3 兩組治療前后sCD40L、lL-1β、lL-6水平比較 (±s)

注：與同組治療前比較1)P＜0.05；與藥物組比較2)P＜0.05

項(xiàng)目 藥物組 針?biāo)幗M治療前 治療后 治療前 治療后sCD40L(ng/mL) 5.25±0.42 3.28±0.221) 5.88±0.64 2.15±0.161)2)IL-1β(pg/mL) 16.42±3.53 8.23±2.161) 15.78±3.44 7.89±2.641)IL-6(μg/L) 12.37±3.24 6.25±1.881) 14.56±2.58 3.65±1.271)2)

3.4.3 兩組臨床療效比較

根據(jù)NIHSS評(píng)分，兩組患者治療后神經(jīng)功能均得到了有效改善。藥物組及針?biāo)幗M總有效率分別為86.0%和98.0%，針?biāo)幗M總有效率明顯高于藥物組。詳見表4。

表4 兩組臨床療效比較 (例)

3.5 不良事件

對(duì)兩組患者進(jìn)行治療后隨訪，藥物組不良事件總發(fā)生率為54.0%，而針?biāo)幗M為10.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表5。

表5 兩組不良事件發(fā)生率比較 (例)

4 討論

缺血性卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇[17-18]，由《難經(jīng)·二十八難》及《素問·骨空論》等中醫(yī)古書中的描述可知，本病的發(fā)生與心、肝、腎等重要器官的陰陽失調(diào)有關(guān)[19-21]，基于以上理論提出了針灸通督的方法來治療缺血性卒中[22-24]，但目前這一療法在缺血性卒中治療中的應(yīng)用仍缺乏有效的臨床數(shù)據(jù)支撐及其具體作用機(jī)制的研究。本研究采用針灸通督法聯(lián)合常規(guī)藥物治療，并通過神經(jīng)功能缺損評(píng)分及卒中后并發(fā)癥發(fā)生率等指標(biāo)觀察了不同治療策略治療缺血性卒中的療效及預(yù)后差異。

CD40是一種分子量約為50 kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員[25]。CD40廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞[26-27]。CD40的配體CD40L是一種大小約為39 kDa的跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子家族成員，機(jī)體內(nèi)多種炎癥刺激因子如IFN-γ、IL-1、IL-3、IL-4、TNF-α等水平異常升高會(huì)導(dǎo)致CD40L從活化的血小板表面脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。各種細(xì)胞膜表面的CD40與CD40L結(jié)合后，CD40由細(xì)胞膜表面內(nèi)化并激活，通過調(diào)節(jié)下游包括NF-κB在內(nèi)的多條信號(hào)通路上調(diào)多種促炎及促凝血基因的表達(dá)[28-30]。病理狀態(tài)下CD40/CD40L系統(tǒng)的激活通過調(diào)節(jié)炎癥、免疫及凝血信號(hào)通路在多種心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[31-33]。

因此，本研究重點(diǎn)考察了針灸通督法聯(lián)合藥物對(duì)缺血性卒中治療療效及預(yù)后的改善是否與CD40/CD40L系統(tǒng)的狀態(tài)有關(guān)。研究結(jié)果顯示相較于單純藥物治療，針灸通督法聯(lián)合藥物治療能顯著改善缺血性卒中患者的神經(jīng)功能，且能明顯降低卒中患者治療后不良事件的發(fā)生率。本研究為支持針灸治療在臨床缺血性卒中患者中的應(yīng)用提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。此外，通過檢測(cè)患者外周血中的sCD40L、IL-6、IL-1β等炎癥指標(biāo)的變化，還發(fā)現(xiàn)針灸通督法聯(lián)合藥物治療能夠顯著降低患者血漿sCD40L水平。sCD40L是機(jī)體在急性炎癥反應(yīng)過程中一種重要的生物標(biāo)記物[34]，已有研究報(bào)道了在缺血性卒中過程中血漿sCD40L水平較對(duì)照人群顯著升高，且多篇文獻(xiàn)也證明了sCD40L可以作為多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子在疾病的診斷及預(yù)后判斷中提供指示作用[14，35]。而本研究則證實(shí)了針灸通督法聯(lián)合藥物治療對(duì)sCD40L這一缺血性卒中危險(xiǎn)因子的調(diào)控作用。

Zhang B等[11]報(bào)道了處于CD40 Kozak序列的一個(gè)功能性單核苷酸序列多態(tài)性位點(diǎn)rs1883832能夠通過改變外周血單個(gè)核細(xì)胞CD40 mRNA的表達(dá)以及血漿sCD40L的水平影響個(gè)體缺血性卒中的發(fā)病率，表明了單個(gè)核細(xì)胞中CD40的表達(dá)在疾病過程中受到遺傳及體內(nèi)局部微環(huán)境的影響。本研究也觀察了針灸通督聯(lián)合藥物治療相對(duì)于單純藥物治療對(duì)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD40 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示針灸通督聯(lián)合藥物治療能夠使急性缺血性卒中患者單個(gè)核細(xì)胞中CD40 mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著降低，且低于單純藥物治療，表明針灸通督聯(lián)合藥物治療能夠更有效地干預(yù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD40的表達(dá)水平。由于CD40/CD40L系統(tǒng)活性在機(jī)體炎癥反應(yīng)中的重要作用[36]，本研究還觀察了體內(nèi)的主要炎性指標(biāo)如IL-6、IL-1β等的表達(dá)水平，針灸通督聯(lián)合藥物治療后可以使患者血漿IL-6、IL-1β的水平明顯下調(diào)，表明了針灸通督聯(lián)合藥物治療能夠通過調(diào)節(jié)CD40/CD40L系統(tǒng)活性降低缺血性卒中患者的急性炎癥水平，從而有利于患者的恢復(fù)。本研究還觀察了兩組患者治療后不良事件的發(fā)生率，其中針灸通督法聯(lián)合藥物治療的患者不良事件發(fā)生率較低，進(jìn)一步證明了針灸通督聯(lián)合藥物治療的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，針灸通督聯(lián)合常規(guī)藥物治療能提高臨床治療急性缺血性卒中患者的療效并減少治療后不良事件的發(fā)生率，其機(jī)制可能與聯(lián)合治療方案能更有效地抑制CD40/CD40L的活性有關(guān)。但由于本次研究兩組患者樣本量較小，隨訪時(shí)間較短，所得結(jié)論及具體的機(jī)制分析仍需要在下一步的研究中進(jìn)行深入探討。