黃琴，謝寧，羅納川，韓靜霆，徐文苑

（南昌大學(xué) 1.第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006；2.第一臨床醫(yī)學(xué)院2017級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，南昌 330031）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的自身免疫性疾病。MS通過致神經(jīng)變性作用導(dǎo)致患者不可逆的神經(jīng)損傷和殘疾［1-2］。目前，MS急性期主要采用激素沖擊、靜脈注射免疫球蛋白和血漿置換治療，但這些治療方案復(fù)發(fā)率均較高。臨床上亟需能夠有效地降低MS致殘率及復(fù)發(fā)率的治療途徑。

粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-csf）是一種多效細胞生長因子，是先天性免疫反應(yīng)的激活劑及適應(yīng)性免疫反應(yīng)的抑制因子［3］，能動員內(nèi)源性干細胞參與MS的治療，且安全有效［4］。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種主要由肝臟和腎臟分泌的糖蛋白，在促進骨髓紅系祖細胞的增殖和分化中發(fā)揮著重要作用，EPO及其衍生物在MS的動物模型中具有巨大的治療潛力［5-8］。本研究擬探討G-csf和EPO單藥或聯(lián)合用藥治療MS的臨床效果，旨在探索治療MS的新途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2010年5月至2014年5月診治的60例MS患者，均符合McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］。其中，男20例，女40例，年齡25～55歲，平均（39.1±5.7）歲；病程0.5～4.5年，平均（2.4±0.98）年；全面功能障礙評分（Expanded Disability Status Scale，EDSS）3.0～8.5分，平均（6.43±1.15）分；伴有眼球震顫7例，視力障礙22例，運動功能障礙51例，眼肌麻痹11例，感覺障礙48例，假性球麻痹7例，共濟失調(diào)10例。所有患者均行MRI檢查，均伴有脫髓鞘性改變，大腦半球受累44例，腦干13例，小腦10例，頸髓9例，胸髓18例，腰髓1例，伴視神經(jīng)損傷8例，均伴有2個以上部位同時受損。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選研究對象均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合 McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡20～55歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重的糖尿病、心臟病、高血壓、消化性潰瘍、股骨頭壞死、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病或凝血功能障礙；妊娠、過敏體質(zhì)者；患有傳染病、免疫性疾病、遺傳病、惡性腫瘤、腦血管意外；入院前或治療期間發(fā)生嚴(yán)重感染；因各種原因不能應(yīng)用甲基強的松龍、G-csf 和（或）EPO者。

分組：將60例患者隨機分為G-csf組、EPO組、G-csf+EPO聯(lián)合組和對照組，每組15例。各組患者年齡、性別、病程、受累部位、臨床癥狀、輔助檢查及治療前EDSS評分等各項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 各組患者基線資料Tab.1 Baseline data analysis of each group

1.2 治療方案及用藥

（1）對照組：緩慢靜脈滴注甲基強的松龍500 mg/d+0.9%氯化鈉500 mL，1次/d，連續(xù)5 d，隨后改為潑尼松口服，逐漸減量［80 mg/（次·d）×10 d，60 mg/（次·d）×5 d，40 mg/（次·d）×5 d，30 mg/（次·d）×5 d，20 mg/（次·d）×5 d，10 mg/（次·d）×5 d］，直至停藥；給予0.9%氯化鈉溶液200 mL靜脈滴注，3次/周×4 周。（2）G-csf 治療組：在對照組治療的基礎(chǔ)上，給予重組人G-csf 5 μg/（kg·d）前臂三角肌皮下注射，連續(xù)應(yīng)用7 d；給予0.9%氯化鈉溶液200 mL靜脈滴注，3次/周×4 周。每日檢查外周血白細胞計數(shù)1次。（3）EPO治療組：在對照組治療的基礎(chǔ)上，靜脈滴注1 500 U/kg重組人EPO+0.9%氯化鈉溶液200 mL，3次/周×4周，用藥當(dāng)天查外周血常規(guī)1次。（4）EPO+G-csf 聯(lián)合組 ：綜合以上3組治療方法，用藥當(dāng)天查外周血常規(guī)1次。

1.3 隨訪

分別于治療前和治療后1、7、14、28 d及3、6、12和24個月，對患者進行EDSS評分；于治療前和治療后14、28 d及3、6、12和24個月，行頭顱MRI（T2WI及增強序列）檢查（3.0T，德國柏林西門子公司）。

療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）影像學(xué)指標(biāo)，觀察頭顱MRI（平掃+增強）病灶大小及數(shù)量，顱內(nèi)增強病灶（contrast-enhancing lesions，CELs）數(shù)目在注射0.1 mmol/kg釓噴酸葡胺5 min后進行掃描收集；（2）EDSS評分，對患者的神經(jīng)系統(tǒng)功能（大腦、腦干、小腦、感覺、大小便、視覺、錐體和其他）［10］進行系統(tǒng)的評價。

主要觀察指標(biāo)：（1）血常規(guī)（外周血白細胞、紅細胞、血紅蛋白水平），血液生化，肝功能，腎功能，凝血功能，D-二聚體；（2）血壓；（3）藥物不良反應(yīng)，包括發(fā)熱、皮疹、胃腸道反應(yīng)、血栓性栓塞事件、肌肉、關(guān)節(jié)和骨骼疼痛等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EDSS評分及頭顱MRI（T2WI）

4組整體分析：EDSS評分及頭顱MRI T2WI病灶數(shù)目在各組間比較、各測量時間點比較及分組和時間的交互作用均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。各治療組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；二者各治療組間比較，聯(lián)合組均優(yōu)于單藥治療組，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二者在單藥治療組間無差異。組內(nèi)時間點間精細比較：各治療組各時間點EDSS評分與治療前、隨訪期間時間點與隨訪前（治療28 d）比較絕大多數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.007），對照組治療期間（其中治療14、28 d后）與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，隨訪時間點中治療后6、12、24個月與治療前比較其增長值超治療前，隨訪各時間點與隨訪前比較（治療28 d后），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.007）。各治療組治療期間各時間點MRI T2WI與治療前比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，隨訪期間時間點與隨訪前（治療28 d后）比較，增長差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.008），聯(lián)合組差異無意義，對照組治療期間，病灶數(shù)目無明顯變化，隨訪期間病灶數(shù)目隨時間增長逐漸增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.008）。見表2～7。

2.2 頭顱MRI增強病灶

表2 各組治療前后EDSS評分整體比較（）Tab.2 Overall comparison of EDSS scores before and after treatment in each group（）

表2 各組治療前后EDSS評分整體比較（）Tab.2 Overall comparison of EDSS scores before and after treatment in each group（）

Overall analysis：two-factor repeated measurement analysis of variance（spherical test）.Comparison between groups：F=6.091，P=0.001.Time point comparison：F=137.864，P＜0.001，G-G adjustment coefficient：0.461.Group×time point：F=26.216，P＜0.001，G-G adjustment coefficient：0.461.

表3 EDSS評分各組間精細比較（單因素方差分析+多重比較）Tab.3 Comparison of EDSS scores between groups（one-way analysis of variance and multiple comparisons）

表4 各組EDSS評分不同時間點比較（配對t檢驗）Tab.4 Comparison of EDSS scores at different time points in each group（paired t test）

表5 各組治療前后頭顱MRI T2WI病灶數(shù)整體比較（）Tab.5 Overall comparison of head MRI T2WI lesions before and after treatment in each group（）

表5 各組治療前后頭顱MRI T2WI病灶數(shù)整體比較（）Tab.5 Overall comparison of head MRI T2WI lesions before and after treatment in each group（）

Overall analysis：two-factor repeated measurement analysis of variance（spherical test）.Comparison between groups：F=6.786，P=0.001.Time point comparison：F=137.864，P＜0.001，G-G adjustment coefficient：0.410.Group×time point：F=26.216，P＜0.001，G-G adjustment coefficient：0.410.

表6 頭顱MRI T2WI病灶數(shù)各組間精細比較（單因素方差分析+多重比較）Tab.6 Comparison of head MRI T2WI lesions between groups（one-way analysis of variance and multiple comparisons）

經(jīng)治療后，對照組及3個治療組影像學(xué)病灶均消失，隨訪期間（治療后3、6、12、24月），各治療組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各治療組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示G-csf或EPO單藥或聯(lián)合治療可延緩MS的復(fù)發(fā)。見表8～9。

2.3 不良反應(yīng)

用藥后出現(xiàn)血壓輕度增高5例，其中，聯(lián)合治療組2例，EPO組3例，停藥后自行緩解。所有患者均無發(fā)熱、皮疹、胃腸道反應(yīng)、血栓性栓塞事件、骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、肌肉、關(guān)節(jié)和骨骼疼痛等不良反應(yīng)。對于使用G-csf的患者，應(yīng)注意監(jiān)控外周血白細胞計數(shù)，如計數(shù)＞25×109/L，則停藥1～2 d觀察；對于使用EPO的患者，需注意使血紅蛋白≤220 g/L。

表7 頭顱MRI T2WI病灶數(shù)各組不同時間點比較（配對t檢驗）Tab.7 Comparison of head MRI T2WI lesions in each group at each time points（paired t test）

表8 各組患者治療前后頭顱MRI增強序列病灶數(shù)Tab.8 Number of head MRI-enhanced sequence lesions before and after treatment in each group

3 討論

MS是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c的自身免疫性疾病，目前尚缺乏有效的治療措施。

本研究在糖皮質(zhì)激素治療的基礎(chǔ)上加用G-csf及EPO治療MS，對患者EDSS評分、MRI T2WI+增強序列病變數(shù)進行評估及隨訪，隨訪周期為24個月。結(jié)果顯示，G-csf、EPO單藥治療或G-csf聯(lián)合EPO治療均能改善患者的EDSS評分，其中以聯(lián)合治療組效果最佳；4組治療后T2WI序列高信號病變數(shù)目均減少，且聯(lián)合治療組明顯優(yōu)于單藥治療組；單藥或聯(lián)合治療組MRI增強序列強化的病灶數(shù)目均較對照組減少（P＜0.05），但單藥組及聯(lián)合治療組無統(tǒng)計學(xué)差異。但是，在隨訪期間，4組MRI增強序列顯示均有不同數(shù)量的復(fù)發(fā)，以聯(lián)合治療組最少，但單藥及聯(lián)合治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是T細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性和脫髓鞘性自身免疫性疾病，廣泛用于人類MS等脫髓鞘疾病的動物模型［11］。研究［12-14］表明，G-csf和EPO能抑制EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥浸潤和脫髓鞘病變，且對EAE具有保護作用，G-csf還能刺激內(nèi)源性神經(jīng)再生，動員骨髓干細胞入血并遷移入腦，促進神經(jīng)功能修復(fù)，據(jù)此筆者推測二者在治療MS等脫髓鞘疾病中可能有聯(lián)合作用，故設(shè)計了本研究。本研究結(jié)果表明，二者聯(lián)合治療MS效果明顯優(yōu)于單藥治療。

NAJMI等［15］的隨機雙盲試驗研究中，將EPO與甲潑尼龍（methylprednisolone，MPred）聯(lián)合用于嚴(yán)重的運動性復(fù)發(fā)緩解型MS患者，觀察到EPO+MPred組MRI T2WI病變數(shù)明顯減少，治療2個月后EPO+MPred組通過動態(tài)指數(shù)（ambulatory index，AI）和EDSS評分觀察到最大行走距離明顯改善，且這種改善一直持續(xù)到治療后的第三個月。MORANSARD等［16］研究發(fā)現(xiàn)，EAE中適度升高的腦內(nèi)EPO水平具有顯著的神經(jīng)保護作用，而無需調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。本研究中，EPO組及聯(lián)合治療組在改善EDSS評分及MRI病灶數(shù)目方面都取得了較好的結(jié)果，再一次驗證了EPO的神經(jīng)保護作用。但其主要作用機制尚不明確，EPO的抗炎癥和增強生存信號機制可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用［5］。

PENG［12］研究發(fā)現(xiàn)G-csf通過誘導(dǎo)EAE模型的自身反應(yīng)性T細胞凋亡，延緩疾病的進展，降低發(fā)病的頻率及嚴(yán)重程度 。其作用機制可能與其作為造血生長因子動員內(nèi)源性干細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，及其抑制炎癥及脫髓鞘變化有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究中，G-csf單藥及聯(lián)合EPO治療組在24個月的隨訪期間均未出現(xiàn)MS復(fù)發(fā)。

MRI T1WI、T2WI，特別是增強像，對MS病灶，尤其是新發(fā)病灶的診斷意義很大。MRI T2WI病變代表MS的累積性病變，均為永久損傷。正常情況下，造影劑（釓噴酸葡胺）本身不能通過血腦屏障，而MS患者顱內(nèi)出現(xiàn)增強病灶，提示血腦屏障滲漏［17-18］，而血腦屏障滲漏則是MS的特點之一，代表疾病的新發(fā)或復(fù)發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單藥組及聯(lián)合治療組T2WI病灶明顯減少，且在24個月的隨訪期間均并未出現(xiàn)病灶增加，表明EPO及G-csf的作用是長效性的。另外，ZHAO等［19］證實G-csf可以自由滲透血腦屏障，LI等［20］研究發(fā)現(xiàn)EPO也能穿過血腦屏障并降低血腦屏障的脫髓鞘和滲透性改變，因此，G-csf和EPO在保護血腦屏障方面具有一定的聯(lián)合作用，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)以往的研究，推測聯(lián)合治療組與單藥治療組在增強病灶方面應(yīng)有差異，但本研究中并未得出相應(yīng)的結(jié)果，可能與樣本量不夠大有關(guān)，這亦是本研究存在的不足之處。

EPO與G-csf用于治療MS安全有效。本研究中，除少數(shù)患者用藥后出現(xiàn)了血壓及血細胞計數(shù)輕度升高外，無其他不良反應(yīng)。MORANSARD等［16］也證實了顱內(nèi)EPO水平只需適度升高即可產(chǎn)生較明顯的神經(jīng)保護效應(yīng)。

綜上所述，本研究將G-csf及EPO聯(lián)合應(yīng)用于MS患者的治療，療效確定且安全，開辟了一條治療多發(fā)性硬化的新途徑，但是二者的作用機制有待進一步研究。