趙興，馬天嬌，羅鋼

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽 110001）

慢性腎臟病是一種威脅人類生命健康的“全球公共健康問題”，其病因復(fù)雜多樣［1］，腎臟纖維化是該病進(jìn)展的共同結(jié)局［2］。研究［3］已證實(shí)，腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎臟纖維化的主要原因，是參與終末期腎臟病形成的共同通路，主導(dǎo)腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸。目前，腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，如何減輕或逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化以延緩終末期腎病的發(fā)生已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral occlusion，UUO）是引起梗阻性腎病的實(shí)驗(yàn)動物模型，用于研究腎臟炎癥和瘢痕形成的各個方面，包括疾病的發(fā)病機(jī)制和潛在的抗炎或抗纖維化治療實(shí)驗(yàn)［4］。研究［5］表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）被 公認(rèn)為是參與EMT最重要的促纖維化因子［6］。本文研究的白細(xì)胞介素樣的EMT誘導(dǎo)因子（interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer，ILEI）參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物過程。本研究采用UUO小鼠和人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞），分別從體內(nèi)及體外兩個方面探討ILEI是否參與腎間質(zhì)纖維化的形成，以期豐富腎間質(zhì)纖維化的分子理論基礎(chǔ)，為慢性腎臟病的治療開發(fā)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性小鼠24只（美國癌癥研究所引進(jìn)，中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），動物批號：SCXK（遼）2008-0005，3～4周齡，體質(zhì)量18～22 g。HK-2細(xì)胞系（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）。人TGF-β1（美國PEPROTECH 公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（美國 Hyclone 公司）；ILEI抗體（英國Abcam公司）；凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（中國麥克奧迪公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組：選取4～6周齡SPF級健康雄性小鼠24只，于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按體質(zhì)量分層后隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、UUO模型7 d組、UUO模型14 d組，每組8只。0周時，以10%水合氯醛（3.5 mL/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，將小鼠固定于手術(shù)臺上，腹部備毛，正中左側(cè)旁切口，打開腹腔，暴露左腎，游離輸尿管。其中模型組小鼠在輸尿管近端及遠(yuǎn)端分別以4.0絲線結(jié)扎，中間離斷關(guān)腹；假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管，不進(jìn)行結(jié)扎；75%乙醇消毒切口。放入飼養(yǎng)籠內(nèi)等待蘇醒，自由飲食。術(shù)后7 d處死8只小鼠，術(shù)后14 d處死余下小鼠，留取手術(shù)側(cè)腎臟組織用于后續(xù)檢測。

1.2.2 Masson染色：取小鼠腎臟組織固定48 h，脫水，透明，包埋，切片后烘干。染色前，切片脫蠟，梯度乙醇脫水，入Masson復(fù)合染液5 min，醋酸洗液洗片，磷鎢酸染色8 min，醋酸洗液再次洗片，甲苯胺藍(lán)染色3 min，醋酸洗液沖洗、經(jīng)乙醇脫水、透明后封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色：小鼠腎組織石蠟切片，經(jīng)枸鹽酸鹽修復(fù)，4 ℃下滴加一抗（1∶200）過夜后，37 ℃下滴加二抗孵育30 min，DAB顯色，脫水、透明、中性樹膠封片。ILEI陽性在鏡下呈棕黃色，進(jìn)行定位分析。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，每張切片選取5個高倍視野，測平均吸光度，取均值作比較。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇HK-2細(xì)胞后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃含有5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長狀態(tài)較佳時收集細(xì)胞，接種于T25塑料培養(yǎng)瓶中并分成正常對照組、5 ng/mL TGF-β1組、10 ng/mL TGF-β1組，每組3×105個細(xì)胞。置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基更換為無血清DMEM，分別加入5和10 ng/mL的TGF-β1，將不添加TGF-β1處理組作為正常對照組。進(jìn)行時間依賴性實(shí)驗(yàn)時，控制每組TGF-β1處理濃度不變，將5 ng/mL TGF-β1組及10 ng/mL TGF-β1組細(xì)胞再置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48及72 h。將各組細(xì)胞在相差顯微鏡（100×）下拍照。

1.2.5 Western blotting：提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度；制備SDS-PAGE膠，上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗4 ℃孵育過夜（ILEI抗體稀釋比例為1∶1 000），加二抗37 ℃孵育45 min，加ECL液顯影，抗體剝脫，采用Gel-Pro-Analyzer凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，小鼠腎組織中ILEI蛋白的表達(dá)水平以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 腎組織的病理改變

Masson染色光鏡下可見假手術(shù)組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)清晰，染色均一，未見明顯病變；UUO模型7 d組腎組織結(jié)構(gòu)病變較為嚴(yán)重，部分腎小球皺縮深染，部分腎小管萎縮并出現(xiàn)藍(lán)色膠原蛋白沉積，伴有散在分布的血細(xì)胞浸出，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)萎縮，間質(zhì)區(qū)部分出現(xiàn)藍(lán)色膠原蛋白沉積；UUO模型14 d組腎組織結(jié)構(gòu)病變嚴(yán)重，部分腎小球皺縮，部分腎小管萎縮，腎小管腔不可見，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，可見空泡變性，細(xì)胞扁平，腎間質(zhì)萎縮壞死，間質(zhì)區(qū)大量藍(lán)色膠原蛋白沉積。見圖1。

圖1 腎組織Masson染色分析 ×200Fig.1 Masson staining of renal tissue ×200

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測ILEI在腎組織中表達(dá)

光鏡下觀察每組小鼠的腎組織，假手術(shù)組小鼠腎組織中可見微量ILEI棕黃色陽性表達(dá)顆粒，UUO模型7 d組小鼠腎組織中ILEI棕黃色陽性表達(dá)顆粒明顯增多，UUO模型14 d組小鼠腎組織中ILEI棕黃色陽性表達(dá)顆粒減少。假手術(shù)組、UUO模型7 d組、UUO模型14 d組ILEI平均吸光度值分別為0.002 0±0.000 5、0.024 6±0.006 1、0.001 7±0.000 5（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ILEI表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析 ×400Fig.2 ILEI expression analyzed by immunohistochemistry ×400

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)改變

5 ng/mL TGF-β1處理HK-2細(xì)胞72 h后，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。正常對照組HK-2細(xì)胞具有上皮細(xì)胞典型的鋪路石樣形態(tài)，為橢圓形或圓形。TGF-β1誘導(dǎo)后，HK-2細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞形態(tài)變長、變大，同倍率視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量減少。見圖3。

圖3 倒置顯微鏡下觀察TGF-β1誘導(dǎo)對HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響 ×100Fig.3 Morphological changes in HK-2 cells treated by TGF-β1 observed under an inverted microscope ×100

2.4 TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞ILEI的蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果證實(shí)：HK-2細(xì)胞幾乎不表達(dá)ILEI，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，其ILEI表達(dá)量逐漸增多。且隨著TGF-β1作用時間延長ILEI表達(dá)量逐漸升高，48 h達(dá)到高峰（P＜0.05），72 h與24和48 h比較明顯下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 不同濃度的TGF-β1作用HK-2細(xì)胞對ILEI蛋白表達(dá)的影響Fig.4 ILEI expression in HK-2 cells treated with TGF-β1 for different time periods and at different concentrations

3 討論

纖維化是多種慢性疾病進(jìn)展到終末期時共同經(jīng)歷的病理過程，腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎功能衰竭的病理表現(xiàn)。腎間質(zhì)纖維化影響慢性腎臟疾病的預(yù)后并主導(dǎo)腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸。肌成纖維細(xì)胞是一群位于腎間質(zhì)、具有平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征的一類細(xì)胞，同時也是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要效應(yīng)細(xì)胞。目前認(rèn)為，腎間質(zhì)纖維化以肌成纖維細(xì)胞增殖和活化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生和異常沉積為特征［7］。據(jù)文獻(xiàn)報道，EMT與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移［8］、復(fù)發(fā)［9］和器官纖維化等疾病的病理過程密切相關(guān)。EMT是間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的重要來源，是腎臟纖維化形成的重要環(huán)節(jié)［10］。腎小管上皮細(xì)胞是最易受損的腎臟固有細(xì)胞，研究［11］表明，發(fā)生EMT的腎小管上皮細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的主要來源之一，其維持和促進(jìn)腎臟纖維化的作用已成為近年研究熱點(diǎn)。本研究針對慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行分子研究，為早期控制疾病進(jìn)展及優(yōu)化患者治療方案提供新思路。

EMT是指腎臟受損后，腎小管上皮細(xì)胞喪失了原有上皮細(xì)胞的表型，獲得間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和特征。這一過程包括4個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：（1）上皮細(xì)胞失去黏附特性；（2）間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白如α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白重新合成；（3）腎小管基底膜被破壞；（4）細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)［12］。有許多細(xì)胞通路激活并刺激 EMT 發(fā)生，如 TGF-β、成纖維細(xì)胞生長因子等。其中，TGF-β1作為最重要的促纖維化因子，是EMT的核心因子，啟動并調(diào)節(jié)EMT的全過程［12］。研究［13］已證明，幾乎所有慢性腎臟疾病的人類標(biāo)本或動物研究模型中均可檢測到TGF-βl表達(dá)上調(diào)。

2002年發(fā)現(xiàn)的蛋白序列相似度為3的類細(xì)胞因子家族（family with similarity 3，F(xiàn)AM3）包括4個成員（FAM3A、FAM3B、FAM3C、FAM3D）。現(xiàn)有研究表明，F(xiàn)AM3基因家族成員可能在糖尿病、腫瘤等多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。FAM3C是FAM家族成員之一，又稱為ILEI，最初是作為參與常染色體隱性遺傳的非綜合征性聽力喪失的候選基因被發(fā)現(xiàn)，是視網(wǎng)膜形成的關(guān)鍵因子［14］。近年來，先后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ILEI在多種生物過程中發(fā)揮作用，包括阿爾茨海默?。?5］、骨密度調(diào)控［16］、腎間質(zhì)纖維化［17］以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等［18］。

根據(jù)UUO小鼠模型Masson染色，可以觀察到假手術(shù)組小鼠腎組織中腎間質(zhì)未見明顯病變，UUO模型7 d組小鼠腎間質(zhì)區(qū)部分出現(xiàn)藍(lán)色膠原蛋白沉積，UUO模型14 d組小鼠腎間質(zhì)區(qū)大量藍(lán)色膠原蛋白沉積，腎臟纖維化明顯，提示腎小管EMT模型制作成功。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO模型7 d組小鼠腎組織中ILEI表達(dá)量明顯增多，UUO模型14 d組ILEI表達(dá)量較前下降。在UUO模型建立數(shù)小時后黏附因子和趨化因子分泌增加，并持續(xù)7～10 d，此時是炎癥反應(yīng)的高峰期，ILEI表達(dá)量升高明顯，說明ILEI很可能參與了該病變過程。

另外本研究發(fā)現(xiàn)，HK-2細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)后，其ILEI的蛋白表達(dá)量在48 h內(nèi)也顯著增多。既往研究［19］已證實(shí)，TGF-β1能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)的改變，且隨著TGF-β1作用時間的延長，ILEI的表達(dá)量逐漸升高。因此，推測ILEI與TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT存在密切關(guān)系。

綜上所述，本研究的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了ILEI在腎間質(zhì)纖維化中表達(dá)量變化明顯，認(rèn)為其參與腎間質(zhì)纖維化的形成，在腎間質(zhì)纖維化中扮演重要角色。