陳漢澤，田力，滕偉禹

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001；2.附屬盛京醫(yī)院老年病科，沈陽 110004）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是臨床常見的急重癥之一，占全部卒中的10%～15%［1］。其高致死率和致殘率給患者帶來了極大災(zāi)難。最新調(diào)查研究［2］顯示近年來ICH患者死亡率有所下降，但是致殘率卻有升高趨勢。組織蛋白酶L（cathepsin L，Cat L）是一種廣泛存在的嗜酸性溶酶體蛋白水解酶。主要分布于溶酶體中，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中也有分布［3］。Cat L 主要參與蛋白質(zhì)降解，在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白平衡方面起重要作用，與多種病理生理過程（自噬、凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)加工等［4-5］）有關(guān)。最近，研究發(fā)現(xiàn)Cat L 參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。òV呆［6］、帕金森?。?］、腦梗死［8］等）。本研究擬建立實(shí)驗性ICH大鼠模型，檢測大鼠腦組織中Cat L表達(dá)，探討Cat L在ICH中的作用及病理意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組

雄性SPF級Wistar大鼠135只，體質(zhì)量250～280 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物部提供。大鼠隨機(jī)分為3組：Z-FY-CHO組［45只，ICH大鼠模型建立后側(cè)腦室注射Cat L選擇性抑制劑Z-FY-CHO溶液（美國Sigma公司，2 μL，1 μg/μL）］，ICH組（45只，ICH大鼠模型建立后側(cè)腦室注射2 μL 10%DMSO溶液），假手術(shù)組（45只，基底節(jié)注射100 μL生理鹽水）。在造模后1、3、7、14 d，各組中隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估以及腦含水量檢測；5只大鼠進(jìn)行血腦屏障通透性檢測。

1.2 ICH大鼠模型制備及給藥

采用自體血模型構(gòu)建ICH大鼠模型。大鼠用麻醉機(jī)麻醉后，取仰臥位固定，消毒后切開腹股溝皮膚暴露股動脈，用微量注射器抽取100 μL動脈血。止血后，迅速裝上耳桿，固定于立體定位儀上。將石蠟油涂在大鼠眼球上，剪去大鼠頭顱頂部毛發(fā)切開皮膚，3%雙氧水涂于大鼠顱骨表面，暴露出前囟位置。在大鼠前囟右側(cè)3.5 mm、前方0.5 mm處用手電鉆輕輕鉆開顱骨，將微量注射器固定于相應(yīng)位置緩緩插入，深度5.0 mm，停留2 min，繼續(xù)插入0.5 mm，停留5 min，隨后將50 μL血液注入（10 μL/min），停留5 min后再將剩余50 μL血液以相同速度注入鼠腦中。停留20 min后將注射器緩緩拔出，縫合大鼠皮膚，待大鼠恢復(fù)意識后，將其送回鼠籠，給予充足食物和水并單獨(dú)飼養(yǎng)。假手術(shù)組在相同條件下，注射相同體積的生理鹽水。Z-FY-CHO組于造模后2 h，側(cè)腦室注射Z-FY-CHO溶液（2 μL/只，1 μg/μL，10% DMSO溶液），ICH組造模后2 h側(cè)腦室注射10%DMSO溶液2 μL/只。

1.3 實(shí)時PCR檢測

實(shí)時 PCR試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，所需引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。定量PCR所用引物及探針序列見表1。術(shù)后第3天將大鼠麻醉后取腦，通過 Taqman探針法，以GAPDH為內(nèi)參。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，以質(zhì)粒的初始模板絕對量對數(shù)為橫坐標(biāo)、以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以Cat L/GAPDH初始模板量代表每個標(biāo)本Cat LmRNA表達(dá)水平的相對量。每個標(biāo)本檢測3次，結(jié)果取平均值。分別提取假手術(shù)組、ICH組、Z-FY-CHO組腦組織的cDNA，與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時PCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Cat L與GAPDH的初始模板量比值。

表1 RT-PCR所需引物及探針序列Tab.1 Primers and probe sequences for real-time quantitative polymerase chain reaction testing

1.4 行為學(xué)測定

利用神經(jīng)功能評分表［9］對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估。評估內(nèi)容包括對稱性、步態(tài)、攀爬、旋轉(zhuǎn)行為、前肢對稱性、強(qiáng)制轉(zhuǎn)圈、胡須反應(yīng)。每項分為0～4分5個等級，最高得分為28分。

1.5 腦含水量測定

大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，去除嗅球和小腦后將大腦分成左右兩半球，取出血一側(cè)半球，稱量其濕質(zhì)量后，置于100 ℃烘箱中24 h，稱量其干質(zhì)量，腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.6 血腦屏障通透性測定

大鼠處死前1 h靜脈注射2%依文思藍(lán)（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，4 mL/kg），處死后立即心臟灌注肝素化生理鹽水，將出血一側(cè)大腦半球浸入甲酰胺（3 mL/100 mg），60 ℃孵育24 h，15 000g離心30 min，在610 nm處測上清吸光度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算依文思藍(lán)含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織中Cat L mRNA表達(dá)水平

結(jié)果顯示，假手術(shù)組、ICH 組、Z-FY-CHO組腦組織中Cat LmRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、5.00±0.51、2.43±0.26。與假手術(shù)組比較，ICH組、ZFY-CHO組腦組織中Cat LmRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；與ICH組比較，Z-FY-CHO組腦組織中Cat LmRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，ICH組大鼠在造模后1、3、7、14 d時神經(jīng)功能評分均明顯升高（P＜0.05）。與ICH組比較，Z-FY-CHO組在3 d時神經(jīng)功能評分明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量比較Tab.2 Neurologic impairment scores and brain water content of the different groups

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，ICH組在造模后1、3、7 d時大鼠腦含水量明顯升高（P＜0.05）。與ICH組比較，Z-FY-CHO組在造模后1、3 d時大鼠腦含水量明顯降低（P＜0.05），見表2。

2.4 各組大鼠血腦屏障通透性比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，ICH組在造模后1、3、7、14 d時大鼠腦組織依文思藍(lán)含量均明顯升高（P＜0.05）。與ICH組比較，造模后1、3 d時Z-FY-CHO組大鼠腦組織依文思藍(lán)含量明顯降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血腦屏障通透性比較Tab.3 Eveas blue content in the brains of the different groups

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Cat L在神經(jīng)組織中有較高表達(dá)，且在腦梗死后，梗死區(qū)域周圍微血管、鄰膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中Cat L 的表達(dá)明顯升高［8］，而抑制Cat L 的表達(dá)可以促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)［10］。本研究結(jié)果顯示，在ICH大鼠腦組織中Cat LmRNA表達(dá)量明顯升高，Z-FY-CHO抑制Cat LmRNA表達(dá)，因此Z-FY-CHO可以有效促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕腦水腫，減輕血腦屏障破壞程度，提示Cat L在ICH疾病進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

ICH后進(jìn)入腦組織中的血腫主要由紅細(xì)胞、凝血因子、免疫球蛋白和補(bǔ)體等構(gòu)成。研究［11］發(fā)現(xiàn)，這些成分均可以通過小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，引起周圍細(xì)胞死亡，而死亡的細(xì)胞釋放的一系列危險相關(guān)模式分子又可以反過來激活更多的小膠質(zhì)細(xì)胞［12］，形成的惡性循環(huán)不斷加重腦組織損傷。除此之外，Cat L在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活過程中發(fā)揮重要作用［13］，研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞是Cat L的重要來源，小膠質(zhì)細(xì)胞接受脂多糖處理后，迅速釋放大量Cat L，釋放出的Cat L降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而Cat L釋放要早于一系列炎性細(xì)胞因子（iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、NO等），說明Cat L可能起到促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用［14］。XU等［13］研究發(fā)現(xiàn)不管是動物還是細(xì)胞實(shí)驗，抑制Cat L都可以有效減少小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制Cat L還可以減少caspase-8激活，從而減輕凋亡反應(yīng)。Cat L還可以將促凋亡蛋白Bid剪切成為tBid，繼而使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。血腦屏障是位于血液和腦組織之間的一層選擇性界面，主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接、基底膜、周細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞終足構(gòu)成，而激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放出的Cat L 可以破壞這些結(jié)構(gòu)，從而破壞血腦屏障，加重神經(jīng)損傷［15］。

本研究通過注射自體血建立ICH大鼠模型，結(jié)果顯示Z-FY-CHO可以有效抑制Cat L表達(dá)，并且隨著Cat L表達(dá)降低大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)加快，腦含水量也明顯降低。分析其原因可能是Cat L參與出血后炎癥和凋亡反應(yīng)，抑制Cat L表達(dá)減輕了炎癥反應(yīng)，減少了細(xì)胞凋亡，減輕血腦屏障破壞程度，從而導(dǎo)致大鼠神經(jīng)損傷減輕。

綜上所述，實(shí)驗性ICH大鼠腦組織中Cat L表達(dá)上調(diào)，Cat L抑制劑Z-FY-CHO能夠抑制Cat L表達(dá)，降低腦含水量，減輕血腦屏障破壞，減輕神經(jīng)損傷程度。Cat L參與了ICH后神經(jīng)損傷過程，Cat L抑制劑可能成為ICH治療的新方向，而Cat L在ICH進(jìn)程中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。