劉雨薇，曲藝，顏曉菁

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，沈陽 110001）

成人急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾?。?］。臨床上超過50%的成人ALL患者化療后不緩解或者緩解后復(fù)發(fā)，且一旦復(fù)發(fā)再次完全緩解率低，患者總體預(yù)后不良［2］。目前，其分子機(jī)制尚未完全明確。亟需對ALL發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，以尋找新的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點。

乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）家族是一類依賴NAD（P）+來催化內(nèi)源性和外源性的醛氧化成為相應(yīng)羧基酸的酶。在人體中發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)超家族由19個成員組成［3］，定位在不同的染色體上。ALDH基因家族廣泛參與體內(nèi)各種脂類的代謝，可以降解細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)，對細(xì)胞有保護(hù)作用［4-6］。同時，ALDH基因家族還被證實與惡性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［7-12］。

ALDH3B1是ALDH的家族成員，其編碼基因位于11q13.2，編碼蛋白長度為52×103［9-11］。目前ALDH3B1的研究相對較少，其功能尚不清楚，與細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除及維甲酸代謝相關(guān)［12-14］。本研究擬明確ALDH3B1基因在ALL患者中的表達(dá)情況，并對其臨床意義進(jìn)行分析，進(jìn)而初步探索其在ALL細(xì)胞系中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象和臨床數(shù)據(jù)采集

納入2012年1月至 2016年2月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科初診的43例ALL患者（ALL組），經(jīng)過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫分型等檢查確診為ALL，均為 L2 型。其中T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）5例，B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）38例，男∶女=23∶20，平均年齡 40.1（16～67）歲。收集患者的臨床信息。實驗室檢查包括初診時骨髓中原始細(xì)胞數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、血小板數(shù)、染色體核型分析、融合基因檢測結(jié)果、二代測序結(jié)果。臨床治療情況包括是否達(dá)到完全緩解、治療方案（包括造血干細(xì)胞移植）、復(fù)發(fā)情況、生存時間等。選擇同期20例非造血系統(tǒng)惡性疾病患者作為對照組，男∶女=5∶15，平均年齡 50.8（16～73）歲。分離患者骨髓單個核細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行檢測。用于研究的骨髓細(xì)胞均來自臨床檢驗的剩余標(biāo)本，且均獲得了患者的知情同意。

1.2 主要試劑

高效 cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，SYBR Premix Ex Taq購自日本TaKaRa公司。人ALL細(xì)胞系Jurkat、Molt-4購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，骨架質(zhì)粒、Transfect慢病毒包裝試劑、聚凝胺購自中國和元生物技術(shù)（上海）有限公司。嘌呤霉素購自美國Solarbio公司，纖連蛋白購自美國EMD Milipore公司，CCK-8購自日本同仁?？贵w：ALDH3B1購自美國Thermo公司，GAPDH和二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。PVDF膜、ECL檢測發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄：采用TRIzol Reagent法提取總 RNA。根據(jù)測定濃度將RNA均稀釋至200 ng/μL，根據(jù)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3.2 實時定量PCR：ALDH3B1引物，上游序列5’-C ATCCTGCCCATCGTGAA-3’，下游序列5’-GTGCATG AAGCCGTCGTT-3’，產(chǎn)物長度為169 bp。GAPDH引物，上 游 序 列5’-TTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游序列5’-CTGTGGTCATGAGTCCTT-3’，產(chǎn)物長度為142 bp。按照 SYBR Premix Ex Taq 的說明配制定量 PCR 反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，從程序中讀取Ct值。計算2-△△Ct進(jìn)行相對定量，△Ct=CtALDH3B1-CtGAPDH。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)：ALL細(xì)胞系Jurkat、Molt-4、BALL-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 1640培養(yǎng)液。293T細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞密度進(jìn)行傳代。

1.3.4 ALDH3B1病毒的制備：空載質(zhì)粒H149 pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，過表達(dá)質(zhì)粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-ALDH3B1-3Flag，293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h換用Opti-MEM培養(yǎng)基，將制備好的包裝試劑和質(zhì)粒復(fù)合物（骨架質(zhì)?！么┧筚|(zhì)粒=1∶1）加入培養(yǎng)基靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃孵育6～8 h后吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48和72 h收集上清，上清液3 500 r/min離心10 min，棄掉沉淀后用0.22 μm濾膜過濾，30 000 r/min、4 ℃離心2 h，棄上清，用100～200 μL培養(yǎng)預(yù)冷的 DPBS重懸，4 ℃過夜，分裝后測滴度。

1.3.5ALDH3B1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系的建立：Jurkat細(xì)胞系以1×105/mL的密度按照最適感染復(fù)數(shù)MOI加入病毒，加入聚凝胺（終濃度為5 μg/mL）轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)72～96 h后用嘌呤霉素（最適濃度為3 μg/mL）篩選穩(wěn)定株。培養(yǎng)1個月后用實時定量PCR和Western blotting法驗證穩(wěn)定細(xì)胞系中ALDH3B1的表達(dá)情況。

1.3.6 細(xì)胞增殖實驗：以1×105/mL的密度接種細(xì)胞至96孔板，于0、24、48、72 h每孔加入CCK-8試劑 10 μL，孵育90 min后測450 nm吸光度（optical density，OD），OD值與活細(xì)胞數(shù)成正比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

按照ALDH3B1表達(dá)量從高到低排序，以總例數(shù)的75%為界分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，實驗結(jié)果采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析和非配對t檢驗比較各組間的差異，采用生存曲線比較生存時間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH3B1基因的表達(dá)情況和臨床數(shù)據(jù)分析

檢測初發(fā)ALL組45例患者和對照組20例非造血系統(tǒng)惡性疾病患者骨髓單個核細(xì)胞中ALDH3B1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，初發(fā)ALL組患者中ALDH3B1的表達(dá)水平明顯低于對照組（P=0.000 6），見圖1。

進(jìn)一步分析ALL患者中ALDH3B1的表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性。以患者初診時白細(xì)胞數(shù)＞30×109/L（B-ALL）或＞100×109/L（T-ALL）為高白細(xì)胞血癥，結(jié)果顯示，高白細(xì)胞血癥患者ALDH3B1基因的表達(dá)水平低于非高白細(xì)胞血癥患者（P=0.035 8）。20例ALL患者在我院治療并且獲得隨訪信息，其中16例緩解后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)患者ALDH3B1基因的表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)患者降低（P=0.046 2）。見表1。

圖1 2組患者ALDH3B1的表達(dá)Fig.1 ALDH3B1 expression in the two groups

表1 ALL患者的臨床特征與ALDH3B1基因表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between the clinical characteristics of patients with acute lymphoblastic leukemia and the expression of ALDH3B1 gene

急性白血病患者初始時白細(xì)胞數(shù)量增高以及疾病復(fù)發(fā)是預(yù)后不良的指標(biāo)，本研究分析了ALDH3B1基因表達(dá)水平和患者生存情況的關(guān)系，以總例數(shù)的75%作為分界，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，生存時間按照隨訪時生存天數(shù)計算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH3B1低表達(dá)患者生存時間明顯低于高表達(dá)患者（P=0.034 1，圖2），提示ALDH3B1低表達(dá)是一個預(yù)后不良的標(biāo)志。

2.2 ALDH3B1基因在ALL發(fā)病中的初步功能學(xué)研究

圖2 ALDH3B1表達(dá)水平與總生存時間的關(guān)系Fig.2 Relationship between ALDH3B1 expression and overall survival time

本研究首先檢測了不同ALL細(xì)胞系中ALDH3B1基因的表達(dá)情況（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-ALL細(xì)胞系Jurkat和Molt-4以及B-ALL細(xì)胞系BALL-1中ALDH3B1基因表達(dá)水平均較對照組降低（P＜0.05）。且T-ALL細(xì)胞系A(chǔ)LDH3B1基因表達(dá)水平較B-ALL細(xì)胞系更低（P＜0.05）。

圖3 ALL細(xì)胞系中ALDH3B1的表達(dá)水平Fig.3 ALDH3B1 expression levels in acute lymphoblastic leukemia cell lines

然后本研究構(gòu)建了ALDH3B1過表達(dá)質(zhì)粒并包裝了過表達(dá)病毒，建立了ALDH3B1穩(wěn)定過表達(dá)的Jurkat細(xì)胞系，采用實時定量PCR和Western blotting檢測ALDH3B1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)LDH3B1的表達(dá)水平較空載對照組明顯增加（圖4）。隨后，本研究用建立的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行了初步的功能性研究，采用CCK-8方法檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞增殖在48和72 h均明顯低于空載對照組和空白對照組（均P＜0.05，圖5）。

圖4 在Jurkat細(xì)胞中驗證ALDH3B1過表達(dá)Fig.4 Verification of ALDH3B1 overexpression in Jurkat cells

圖5 過表達(dá)ALDH3B1對Jurkat細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of ALDH3B1 overexpression on the proliferation of Jurkat cells

3 討論

ALL發(fā)病年齡呈雙峰，集中在兒童期和50歲左右。ALL兒童常規(guī)化療效果明顯好于成人，5年總生存率約為90%。ALL成人患者總體療效相對較差，近年來隨著兒童化療方案在成人中的應(yīng)用，靶向治療和移植技術(shù)的進(jìn)展，成人ALL的預(yù)后已經(jīng)得到改善，患者完全緩解率較高，但仍有相當(dāng)多的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥，5年生存率僅為30%～40%［2］。因此，需要進(jìn)一步研究ALL發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為診治和判定預(yù)后提供新的分子標(biāo)志。

ALL是一種起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。代謝異?，F(xiàn)在被認(rèn)為是癌癥的特征之一，腫瘤代謝譜檢測或者某些調(diào)節(jié)代謝的基因可以用于腫瘤患者的診斷、療效評估和預(yù)后判定，亦可用于癌癥的治療，針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或酶機(jī)制設(shè)計靶向治療藥物［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)，一種編碼醛脫氫酶超家族成員之一的基因ALDH3B1在ALL中表達(dá)減低，且與患者初診時白細(xì)胞數(shù)量增高有關(guān)，目前認(rèn)為成人ALL的不良預(yù)后與患者診斷時白細(xì)胞數(shù)高、混合系白血病基因陽性［如t（4；11）］、Ph染色體陽性、亞二倍體等［1］有關(guān)。與此一致，本研究結(jié)果顯示ALDH3B1低表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率更高，長期生存時間更短，提示ALDH3B1低表達(dá)可以作為一個有效的預(yù)后判定分子標(biāo)志。但因病例數(shù)較少，ALDH3B1表達(dá)水平與ALL患者染色體異常以及基因突變之間的關(guān)系本研究并未分析，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本加以研究。本研究結(jié)果也提示，ALDH3B1可能作為抑癌基因參與了白血病的發(fā)生發(fā)展。

ALDH超家族蛋白廣泛參與體內(nèi)各種脂類、氨基酸和抗體的代謝，參與內(nèi)、外源性醛與其相應(yīng)酸的不可逆氧化反應(yīng)。ALDH基因家族還被證實與惡性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如ALDH2與再生障礙性貧血、白血病的進(jìn)展相關(guān)［7］。但ALDH3B1與腫瘤的關(guān)系目前尚不清楚。本研究通過初步的功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ALDH31確實可以抑制白血病細(xì)胞的增殖，其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。有研究［14］表明，ALDH3B1與活性氧代謝相關(guān)，活性氧在生物體中不斷產(chǎn)生，無法處理活性氧負(fù)擔(dān)會增加氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA的改變，細(xì)胞磷脂的脂質(zhì)過氧化，能產(chǎn)生超過200種反應(yīng)性醛，而ALDH可以通過代謝多種醛類減弱氧化應(yīng)激。因此可以推測，ALDH3B1表達(dá)增高，可能通過代謝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的反應(yīng)性醛影響白血病細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，從而影響細(xì)胞的活性，其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明ALDH3B1可能參與了ALL的發(fā)病過程，且可以作為一個新的潛在分子標(biāo)志物用于ALL的診斷和預(yù)后判定。