魏松喬，郭澍，佟爽，朱夢(mèng)茹，張華，陳義慶，崔夢(mèng)瑩

（中國科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，沈陽 110001）

骨再生是細(xì)胞、血管基質(zhì)和生長(zhǎng)因子共同作用的復(fù)雜結(jié)果［1］。近年來，骨組織工程及再生醫(yī)學(xué)的興起使生物材料及細(xì)胞水平的治療成為骨再生領(lǐng)域中2個(gè)主要研究方向［2］。骨組織工程是由合適的種子細(xì)胞、可降解的支架材料以及生長(zhǎng)因子3個(gè)因素構(gòu)成［3］，用于骨組織工程的種子細(xì)胞應(yīng)具有多向分化潛能且傳代性質(zhì)穩(wěn)定［4］，人工骨支架的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能須優(yōu)良［5］。除此之外，影響細(xì)胞間信號(hào)傳遞的因子對(duì)骨再生也有著至關(guān)重要的影響［3］。因此，在種子細(xì)胞與支架良好結(jié)合的前提下，加入既可以促進(jìn)種子細(xì)胞成骨分化又可以通過提高細(xì)胞間信號(hào)傳遞從而增強(qiáng)細(xì)胞間相互作用的生長(zhǎng)因子的治療手段，將是一個(gè)潛在的新型治療骨缺損的方法。

研究表明，ADSCs在體外誘導(dǎo)條件下具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多向分化的潛能。絲素/殼聚糖復(fù)合支架（silk fibroin-chitosan scaffold，SF/CS）具有較低的炎癥毒性、良好的生物降解性及骨傳導(dǎo)耦合性［6］。外泌體是直徑介于30～100 nm、起源于細(xì)胞內(nèi)吞作用的小囊泡，大部分細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下均可分泌［7］，其內(nèi)含有多種母細(xì)胞來源的生物活性物質(zhì)［8］，通過這些信息物質(zhì)可以完成細(xì)胞間的信號(hào)傳遞［9］。外泌體中包含的核酸類物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)后可以被翻譯成蛋白質(zhì)，而通過在細(xì)胞間傳遞蛋白和RNA，外泌體可以調(diào)節(jié)靶細(xì)胞及器官的功能和活性［10］，可直接引導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化進(jìn)入成骨細(xì)胞系。所以，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以被用作引導(dǎo)幼稚干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化的生物工具［11］。

本研究通過將外泌體與脂肪干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs）-SF/CS復(fù)合物共培養(yǎng)，探究三維條件下人ADSCs在成骨分化的過程中外泌體對(duì)其的作用，并通過探究ADSCs-SF/CS-外泌體復(fù)合模式在骨組織再生中的應(yīng)用潛能，為后續(xù)修復(fù)骨缺損的骨組織工程研究提供細(xì)胞、生物支架材料和生長(zhǎng)因子3個(gè)方面的資料。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與材料

脂肪由接受腹部抽脂術(shù)的5名25～30歲的健康女性志愿者提供，志愿者對(duì)本研究相關(guān)內(nèi)容知情并簽署知情同意書。本研究相關(guān)內(nèi)容和方法均經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理部門審核并批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和倫理問題等均符合要求。

主要試劑：胰蛋白酶、成骨誘導(dǎo)液、普通液態(tài)培養(yǎng)基（購自美國 Hyclone公司），青鏈霉素、抗真菌劑、胎牛血清（購自美國Gibco公司），蠶絲、氯化鈣、醋酸、CCK-8試劑、Triton X-100（購自美國Sigma公司），BCA蛋白濃度試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（購自中國碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的培養(yǎng)及體外分化：抽脂共獲得腹部皮下液狀脂肪300 mL，清洗除去大塊纖維組織后，經(jīng)膠原酶消化及反復(fù)離心棄脂肪組織及上清，底部沉淀重懸后均勻接種至培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2恒定孵箱內(nèi)，每3 d換液，待細(xì)胞達(dá)80%融合后用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，以1∶3的比例進(jìn)行傳代。取長(zhǎng)勢(shì)良好的第3代ADSCs以1×105/孔的濃度接種于6孔板后普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)接觸抑制3～5 d棄培養(yǎng)基，分別加入成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)液，每3 d換液，直至21 d，4%多聚甲醛固定漂洗后，分別用油紅O、茜素紅及甲苯胺藍(lán)染色鏡檢。

1.2.2 外泌體的提取及鑒定：取長(zhǎng)勢(shì)良好的第3代ADSCs，普通培養(yǎng)液培養(yǎng)至100%融合后加入成骨誘導(dǎo)液（無外泌體血清、地塞米松磷酸鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鉀）培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞上清共180 mL，以4 000g離心30 min，棄沉淀留上清；20 000g離心60 min，棄底留上清；100 000g離心1 h棄上清，加入PBS重懸后，再次以100 000g離心1 h，棄上清后可見沉淀，即為較純濃度外泌體。透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：超速離心提取沉淀以100 μL PBS重懸后，取20 μL加入4%多聚甲醛固定，磷酸鎢染色后透射電鏡下觀察拍照。外泌體蛋白定量檢測(cè)：按照BCA蛋白濃度試劑盒要求操作，求得外泌體實(shí)際濃度并應(yīng)用Western blotting檢測(cè)成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞及所提取外泌體中CD9和CD63標(biāo)記蛋白，采用ECL顯影。

1.2.3 ADSCs-SF/CS復(fù)合物的制備：蠶絲脫膠處理后，經(jīng)透析、過濾、濃縮制得純SF蛋白溶液。將CS溶液以質(zhì)量比5∶5加入SF蛋白溶液中，充分?jǐn)嚢柚频没旌先芤?，再次透析后加?4孔板，真空冷凍干燥機(jī)凍干24 h后漂洗，并再次凍干48 h即可制成。將乙醇浸泡及紫外燈照射滅菌處理的SF/CS浸于細(xì)胞培養(yǎng)液24 h后，將長(zhǎng)勢(shì)良好的第3代ADSCs以1×105/mL的密度均勻接種于支架上（1 mL/個(gè)）。支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察：SF/CS經(jīng)處理后在掃描電鏡下觀察支架材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)并拍照。細(xì)胞貼附情況觀察：細(xì)胞接種后分別在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)取出樣品，經(jīng)處理后掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞與支架的貼附情況。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組：將ADSCs-SF/CS復(fù)合物分為實(shí)驗(yàn)組a（ADSCs-SF/CS+普通培養(yǎng)液+外泌體組）、實(shí)驗(yàn)組b（ADSCs-SF/CS+成骨誘導(dǎo)液+外泌體組）、陽性對(duì)照組（ADSCs-SF/CS+成骨誘導(dǎo)液組）和陰性對(duì)照組（ADSCs-SF/CS+普通誘導(dǎo)液組），分別進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液，連續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.2.5 驗(yàn)證外泌體對(duì)ADSCs-SF/CS復(fù)合物的成骨效應(yīng)：加入外泌體共培養(yǎng)后，分別于培養(yǎng)的第1、3、7天取出實(shí)驗(yàn)組a及陰性對(duì)照組樣本，將細(xì)胞洗脫下來制成細(xì)胞懸液，加入CCK-8試劑，測(cè)定ADSCs的增殖情況。培養(yǎng)14 d后，將各組樣本支架上的細(xì)胞消化下來并裂解，應(yīng)用Western blotting驗(yàn)證成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2的表達(dá)，并按ALP試劑盒說明將樣本與工作液混合，酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的吸光度，從而得出各組樣本ALP活性變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western blotting條帶結(jié)果應(yīng)用Image J圖像分析軟件灰度掃描后，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。各組數(shù)據(jù)均用表示，采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ALP活性檢測(cè)結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的生長(zhǎng)特性及體外誘導(dǎo)結(jié)果

倒置顯微鏡下可見剛傳代的脂肪細(xì)胞呈圓形或橢圓形懸浮于培養(yǎng)液中，24 h可全部貼壁，初期細(xì)胞體積較小，呈紡錘形或梭形；72 h細(xì)胞體積逐漸增大，呈梭形；120 h梭形細(xì)胞大量增殖，局部呈平行或漩渦狀緊密排列（圖1）。分別用油紅O、茜素紅及甲苯胺藍(lán)染色，鏡下所見證實(shí)ADSCs具有向成熟的脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞多向分化的潛能（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡下可見原代培養(yǎng)5 d后ADSCs增長(zhǎng)活躍 ×100Fig.1 Image under an inverted microscope：adipocyte growth was active after primary culturing for 5 days ×100

圖2 ADSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化21 d ×100Fig.2 ADSCs were induced to differentiate into adipocytes，osteoblasts，and chondrocytes after being fostered for 21 d ×100

2.2 外泌體的形態(tài)及鑒定

透射電鏡下可見外泌體直徑介于40～100 nm之間，為具有明顯雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形杯盤狀囊泡（圖3）。應(yīng)用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)得平均每180 mL上清可提取外泌體蛋白濃度約為1.340 μg/μL。Western blotting法以β-actin內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，可見成骨誘導(dǎo)21 d的ADSCs及提取的外泌體中均有CD9和CD63標(biāo)記蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)提取的外泌體來源于成骨分化的ADSCs（圖4）。

2.3 ADSCs-SF/CS復(fù)合物在外泌體誘導(dǎo)下的成骨效應(yīng)

2.3.1 掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架內(nèi)附著情況：電鏡下可見SF/CS材料呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙的走向沒有方向性?？讖酱笮臄?shù)十到300 μm不等，孔與孔之間相連通，孔隙內(nèi)壁平滑平整（圖5），培養(yǎng)1周時(shí)支架表面及孔隙中可見ADSCs黏附，細(xì)胞與支架材料緊密黏接，偽足向各個(gè)方向伸展，細(xì)胞周圍可見細(xì)胞外基質(zhì)（圖6）。

圖3 外泌體透射電鏡圖 ×80 000Fig.3 Exosomes observed under a transmission electron microscope ×80 000

圖4 ADSCs及外泌體的Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Western blotting results of ADSCs and exosomes

圖5 掃描電鏡下SF/CS呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ×200Fig.5 The SF/CS scaffold appears as a porous network structure under scanning electron microscope ×200

圖6 ADSCs可附著于SF/CS表面并生長(zhǎng) ×1 500Fig.6 Proliferation of ADSCs attached to the surface of the SF/CS scaffold ×1 500

2.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：CCK-8法結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組a的ADSCs在培養(yǎng)的第1、3、7天增殖能力呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖7），表明向培養(yǎng)液中加入外泌體有利于ADSCs的增殖。

2.3.3 成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2及ALP活性檢測(cè)：Western blotting法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)14 d時(shí)與陽性對(duì)照組（0.841 3±0.101 2）相比，實(shí)驗(yàn)組b中成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2的表達(dá)含量（1.587 4±0.090 3）增加（圖8）。此外，與陰性對(duì)照組的ALP活性（0.453 7±0.081 3）相比，實(shí)驗(yàn)組a的ALP活性（2.546 2±0.197 6）顯著增高（P＜0.01）；與陽性對(duì)照組的ALP活性相比（1.075 7±0.080 6），實(shí)驗(yàn)組b的ALP活性（3.495 5±0.390 5）也明顯增高（P＜0.01）。表明外泌體不僅可以誘導(dǎo)ADSCs成骨，其對(duì)ADSCs的成骨還具有促進(jìn)作用。

圖7 CCK-8法測(cè)量細(xì)胞增殖活性Fig.7 Cell proliferation activity as measured by CCK-8

圖8 成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2的Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Western blotting results of Runx2

3 討論

本研究結(jié)果顯示，ADSCs不僅具有多向分化的潛能，而且增殖能力強(qiáng)、生物學(xué)特性穩(wěn)定，所以憑借其來源豐富、獲取安全便捷、對(duì)供區(qū)損傷小等優(yōu)勢(shì)，ADSCs可以作為種子細(xì)胞為骨組織修復(fù)提供充足的時(shí)間及原材料。本課題組前期研究［12-13］結(jié)果表明，將SF與CS以質(zhì)量比5∶5的比例共混可制備出功能更加完善的復(fù)合支架，不僅結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，多種良好的生物學(xué)性能也得以保持。本研究通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，人ADSCs與SF/CS復(fù)合后，材料的多孔結(jié)構(gòu)使細(xì)胞易于長(zhǎng)入，其平整的表面和適當(dāng)?shù)目讖娇梢允辜?xì)胞在材料表面和孔隙中增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，在相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞可以在支架上正常的伸展、黏附和生長(zhǎng)，這說明SF/CS對(duì)人ADSCs有良好的親和性和生物相容性。

此外，本課題組前期研究將提取的外泌體按體積比稀釋，形成不同的濃度梯度，并在二維條件下與人ADSCs共培養(yǎng)，以觀察其對(duì)人ADSCs增殖、礦化的影響。結(jié)果證實(shí)，濃度為15 μg/μL的外泌體促進(jìn)ADSCs增殖、礦化的效果最強(qiáng)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖越明顯。因此，本研究先將ADSCs種植于SF/CS，以前期研究結(jié)果為準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)組中加入等量（50 μL）濃度為15 μg/μL的外泌體，在三維環(huán)境中觀察外泌體對(duì)ADSCs成骨分化作用的影響。通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，并驗(yàn)證成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2及ALP的活性變化。本研究結(jié)果顯示，外泌體可以在體外環(huán)境下誘導(dǎo)負(fù)載于SF/CS上的人ADSCs向成骨細(xì)胞分化，并且對(duì)人ADSCs向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。

雖然ADSCs的成骨能力在骨組織工程中具有重要的應(yīng)用潛能，但仍有一些問題尚未解決，如ADSCs成骨分化現(xiàn)象的內(nèi)在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。而且目前關(guān)于誘導(dǎo)ADSCs成骨的研究大多是體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，缺少體內(nèi)研究，要想將ADSCs作為種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床骨組織再生，仍需大量的實(shí)驗(yàn)和臨床前研究。此外，本研究制備的復(fù)合支架雖基本符合目前骨組織工程的生物材料要求，種植細(xì)胞的結(jié)果也表明SF/CS對(duì)ADSCs無明顯毒性和不良反應(yīng)，但其細(xì)胞和組織相容性以及在體內(nèi)的降解情況等仍有待進(jìn)一步研究。最后，外泌體雖然在骨組織修復(fù)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景，但同時(shí)也存在諸多阻礙其發(fā)展的因素，最主要的挑戰(zhàn)就是如何實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)。目前常用的提取方法只能提供少量純度低的外泌體，比如5×106個(gè)骨髓瘤細(xì)胞中只能提取5～6 μg外泌體［14］，且目前常用的2種分離方法——反復(fù)超速離心法和反復(fù)超濾法的弊端均是時(shí)間消耗大。此外，盡管許多研究表明外泌體可以刺激骨生成和血管再生，但確切機(jī)制仍然模糊不清。因此，以后的研究必須首先探索出分離和提取外泌體的可靠方法。其次，需要更好的了解外泌體在調(diào)節(jié)ADSCs成骨和血管生成方面的作用。最后，本研究通過向培養(yǎng)基中加入外泌體的方法來添加促進(jìn)ADSCs成骨的誘導(dǎo)因素，而后期如何制備具有緩釋外泌體效應(yīng)的支架以用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以及最終制備出可以用于人體的外泌體-ADSCs-SF/CS復(fù)合模式，還有待進(jìn)一步研究。