張麗紅 ，郭敏芳，張慧宇，章培軍，邢雁霞，馬存根，薛慧清，趙海寶

（1.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030619；3.大同市第三人民醫(yī)院病理科，山西 大同 037008）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)的特異性炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，具有高致殘、高復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE）是國際上公認(rèn)的研究 MS 的理想動(dòng)物模型。MS和EAE的基本病理過程相似，外周髓鞘抗原特異性T細(xì)胞通過分子模擬機(jī)制被初次激活，穿過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）進(jìn)入CNS，之后被再次激活，釋放各種有害物質(zhì)并誘發(fā)一系列瀑布樣異常免疫應(yīng)答反應(yīng)。近年來，我國MS的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。西藥治療MS效果差，不良反應(yīng)大，因此有不少學(xué)者致力于從中草藥中尋找有效的成分，積極探索尋找新的治療藥物。黃芪為豆科多年生草本植物的干燥根，具有補(bǔ)中益氣之功效，作為一種具有較強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用的中藥，廣泛應(yīng)用于免疫性疾病的臨床治療［1-2］。黃芪糖蛋白（Huangqi glycoprotein，HQGP）是從中藥黃芪中提取純化的一種天然植物糖蛋白，本課題組的前期研究［3-4］發(fā)現(xiàn)HQGP對(duì)EAE 小鼠有一定的抗炎作用，因此推測(cè)其對(duì)EAE的BBB可能具有保護(hù)作用，并可能是抑制炎癥細(xì)胞入侵，減輕臨床癥狀的重要原因。因此，本研究擬探討HQGP對(duì)EAE小鼠BBB通透性的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠40只，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)1周后制造EAE模型，所有動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑：小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG 35-55）購自西安聯(lián)美生物科技有限公司；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）由瑞士Alexis公司提供；結(jié)核分支桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）購自美 國BD公 司；完 全Freund佐 劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）、兔抗小鼠CD4和CD68單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）購自英國AbD Serotec公司；Alexa Fluor 555 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Invitrogen公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EAE小鼠模型制備：隨機(jī)將C57BL/6雌性小鼠分為EAE組和HQGP組，每組20只。MOG35-55的配制與注射均嚴(yán)格參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，免疫當(dāng)天記為免 疫 后0 d（the 0 day post-immunization，d0 p.i.），2組小鼠于d0 p.i.和d2 p.i.均給予腹腔注射PTX增強(qiáng)免疫2次（500 ng/只）。HQGP組在d3 p.i.開始腹腔注射HQGP ［1 mg/（kg·d）］，持續(xù)給藥15 d。

1.2.2 狀態(tài)觀察與評(píng)分：每天由2人對(duì)各組小鼠的一般狀態(tài)進(jìn)行觀察，并對(duì)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分，觀察內(nèi)容包括飲水、攝食、毛發(fā)色澤、體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)功能、發(fā)病情況等，記錄測(cè)量結(jié)果。運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用國際通用的5分法［6］，計(jì)算平均起病時(shí)間（組內(nèi)每只動(dòng)物首發(fā)癥狀天數(shù)的均值）和平均高峰評(píng)分（組內(nèi)每只動(dòng)物最高評(píng)分的均值）。

1.2.3 腦組織含水量的測(cè)定：免疫后第18天，每組各取5只小鼠，快速斷頭，在冰盒中完整剝離腦組織并稱質(zhì)量（腦組織濕質(zhì)量），再將腦組織放入52 ℃電熱恒溫箱烘烤72 h，再稱質(zhì)量（腦組織干質(zhì)量）。計(jì)算腦組織含水量=（腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量）/腦組織濕質(zhì)量。

1.2.4 BBB通透性的檢測(cè)：免疫后第18天，每組各取5只小鼠，末次給藥1 h后，尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)（evans blue，EB）100 μL/只。以小鼠的眼結(jié)膜、四肢、全身皮膚出現(xiàn)明顯藍(lán)染為注射成功，100 g/L水合氯醛麻醉后行生理鹽水灌流，冰盒中迅速剝離腦組織，稱質(zhì)量并記錄腦組織濕質(zhì)量。然后加甲酰胺溶液浸泡，45 ℃避光孵育72 h，充分勻漿后，15 000 r/min離心20 min。在酶標(biāo)儀上630 nm處測(cè)定上清液吸光度值（A）。根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 EB含量，用EB濃度（μg·mL-1）/腦濕質(zhì)量（μg·g-1）表示。

1.2.5 病理標(biāo)本采集及處理：免疫后第18天，每組各取5只小鼠，100 g/L水合氯醛麻醉后行4%多聚甲醛灌流，分離脊髓組織，用冰凍切片包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT）包埋，置液氮蒸汽中凝固后，迅速放入-80 ℃冰箱凍存。制作冰凍切片，厚度10 μm，然后行免疫熒光染色。

1.2.5.1 HE染色 于水中浸泡脊髓冰凍切片2 min，蘇木精染色10 min，水洗1 min，5%鹽酸乙醇分化15 s，伊紅染色30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封片后，顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.5.2 LFB髓鞘染色 95%乙醇浸泡取脊髓冰凍切片3 min，固藍(lán)液中57 ℃孵育24 h，去離子水浸洗3 min，95%乙醇浸洗3 min，0.05%碳酸鋰溶液浸泡15 s，70%乙醇分化至灰白質(zhì)清晰可辨，去離子水迅速?zèng)_洗3 min，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察髓鞘脫失情況。使用Image Pro Plus軟件計(jì)算小鼠髓鞘脫失面積與白質(zhì)面積比值。

1.2.6 免疫熒光染色：取脊髓冰凍切片，室溫晾干，PBS洗5 min×3次，10 g/L BSA-PBS室溫封閉1.5 h后，分別加入1 ∶1 000稀釋的兔抗小鼠CD4和CD68抗體，4 ℃過夜；次日于室溫下再用PBS洗5 min×3次，濾紙吸干，加入Alexa Fluor 555 標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育2 h，PBS洗5 min×3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。使用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)完整切面的炎癥細(xì)胞數(shù)量，比較2組每個(gè)完整切面CD4+和CD68+細(xì)胞數(shù)，分析炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)：脊髓組織提取蛋白定量后，加入5×上樣Buffer，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入1 ∶1 000稀釋的兔抗小鼠Occludin、ZO-1和GADPH一抗，4 ℃過夜；次日TBST洗滌后，加入1 ∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用Bio-RAD凝膠成像儀分析條帶，用Band Scan分析2組Occludin和ZO-1的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，2組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用Student-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HQGP對(duì)EAE小鼠癥狀和病變的影響

與前期研究［7］結(jié)果一致，與EAE模型組比較，HQGP治療可減輕EAE癥狀，延緩發(fā)病。病理結(jié)果顯示，HQGP治療可顯著降低炎癥細(xì)胞向脊髓組織浸潤，降低髓鞘脫失面積。

2.2 腦組織含水量及BBB通透性檢測(cè)結(jié)果

免疫后18 d，HQGP組小鼠腦內(nèi)水、EB含量均低于EAE組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1和表1。

圖1 EAE和HQGP組小鼠腦組織水和EB含量比較Fig.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups

表1 2組小鼠腦組織含水量和EB含量比較（，n=5）Tab.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups（，n=5）

表1 2組小鼠腦組織含水量和EB含量比較（，n=5）Tab.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups（，n=5）

1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs EAE group.

2.3 2組小鼠脊髓炎癥細(xì)胞浸潤情況

2組脊髓腰骶段橫斷面冰凍切片免疫熒光染色顯示，CD4+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞主要在脊髓白質(zhì)區(qū)表達(dá)，且EAE組CD4+T細(xì)胞數(shù)（114.3±11.84）高于HQGP組（46.0±6.72），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示HQGP能明顯減輕CD4+T細(xì)胞向脊髓的浸潤；EAE組CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)（102.70±12.26）顯著高于HQGP組（35.33±13.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示HQGP能明顯減少CD68+巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量。見圖2。

2.4 2組小鼠緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)情況

圖2 2組小鼠脊髓CD4+和CD68+細(xì)胞浸潤情況比較Fig.2 Comparison of CD4+ and CD68+ cell infiltration in spinal cords of EAE and HQGP groups

Western blotting結(jié)果顯示，HQGP組小鼠脊髓內(nèi)細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin表達(dá)水平（2.01±0.14）較EAE組（0.94±0.07）增高，HQGP組小鼠脊髓內(nèi)細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)水平（2.37±0.20）較EAE組（0.964±0.14）增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。見圖3。

圖3 2組小鼠脊髓內(nèi)Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of Occludin and ZO-1 protein expression in spinal cords of EAE and HQGP groups

3 討論

MS及其EAE動(dòng)物模型廣泛用于涉及T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的研究，其特征為淋巴細(xì)胞浸潤、脫髓鞘和軸突損傷［8］。BBB功能障礙是EAE和MS進(jìn)展的主要特征之一，炎性細(xì)胞因子通過受損的BBB遷移至大腦，導(dǎo)致腦水腫、脫髓鞘和神經(jīng)細(xì)胞死亡［9］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥可用于治療復(fù)雜多變的MS，不良反應(yīng)少［10］。HQGP是一種從黃芪中提取的有效成分，對(duì)MS/EAE中的神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)有積極作用［11］。本研究探討了HQGP對(duì)EAE小鼠癱瘓癥狀的潛在保護(hù)作用，結(jié)果表明HQGP延遲了EAE的發(fā)作，改善了EAE的嚴(yán)重程度，且HQGP對(duì)EAE的治療作用至少有一部分是通過強(qiáng)化BBB完整性及抗炎作用介導(dǎo)的。

在EAE的復(fù)雜過程中，涉及免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞，包 括CD4+Th1和Th17，γδT細(xì) 胞，CD8+T細(xì) 胞，Treg細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［12］。CNS的炎癥浸潤主要是由活化的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成［13］。這也說明MS病程中BBB破壞，從而使循環(huán)血液中炎癥細(xì)胞穿過BBB浸潤至CNS。免疫熒光標(biāo)記表明，HQGP處理后，浸潤的CD4+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)顯著減少。證明HQGP可抑制免疫細(xì)胞向脊髓的浸潤，從而有助于改善脊髓的炎癥微環(huán)境，從而提高EAE臨床評(píng)分。

EB染料廣泛用于檢測(cè)BBB滲漏，因?yàn)樗c血清白蛋白結(jié)合形成大分子復(fù)合物，在正常生理環(huán)境下不能穿過完整的BBB。因此，本研究將EB染料進(jìn)入大腦的量作為BBB滲透性的指標(biāo)。結(jié)果表明，與EAE小鼠相比，HQGP處理顯著降低了腦中EB的含量。說明HQGP能防止EAE小鼠模型BBB的破壞。

內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接（tight junction，TJ）由大的多蛋白復(fù)合物組成，是構(gòu)成BBB的主要成分之一，緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白Occludin、claudins和胞質(zhì)蛋白ZO-1組成。Occludin的作用是連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架，影響肌動(dòng)蛋白的收縮性，影響TJ的功能，從而使BBB的通透性明顯低于其他屏障性結(jié)構(gòu)［14］。有研究［15］認(rèn)為Occludin表達(dá)水平可以表明BBB的結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)，其下降程度可以作為BBB損傷程度的標(biāo)志。而ZO-1是與TJ相關(guān)的主要細(xì)胞質(zhì)蛋白。其作用是將Occludin和claudins的COOH末端連接到潛在的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，據(jù)文獻(xiàn)［16］報(bào)道，ZO-1或Occludin表達(dá)的減少能導(dǎo)致BBB通透性增加。本研究結(jié)果顯示，HQGP治療可使EAE小鼠脊髓組織內(nèi)Occludin和ZO-1的表達(dá)增加，表明HQGP能有效地防止EAE模型小鼠中BBB的破壞，促進(jìn)BBB功能的修復(fù)。

總之，本研究表明HQGP可以抑制EAE小鼠CNS炎癥細(xì)胞浸潤，改善脫髓鞘程度，促進(jìn)BBB損傷修復(fù)，具體機(jī)制可能與上調(diào)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞向CNS遷移有關(guān)。