劉舒暢，賴光銳，趙彥艷

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，沈陽 110004）

染色體異常是導(dǎo)致新生兒缺陷的重要原因之一，可通過早期產(chǎn)前檢查發(fā)現(xiàn)。目前，臨床中常用的產(chǎn)前篩查方法，如“唐氏篩查”，雖然廉價，但檢出率低、假陽性率高；超聲遺傳標記物篩查不能判斷胎兒是否有染色體異常；無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)雖然準確性高，但是費用昂貴，且對檢查技術(shù)要求較高，尚不能廣泛應(yīng)用［1］。

文獻［2］顯示，通過羊水穿刺行產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)的染色體異常約占5%～10%。目前，檢測胎兒染色體異常的方法主要有絨毛穿刺取樣、羊膜腔穿刺術(shù)和臍血管穿刺取樣等介入性方法，其中以羊膜腔穿刺術(shù)最為常見。而羊水細胞染色體核型分析作為產(chǎn)前診斷的“金標準”現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于臨床，然而該方法檢測周期長，技術(shù)相對復(fù)雜，有培養(yǎng)失敗的風(fēng)險［3］。因此，臨床上亟需尋找一種能快速進行羊水標本核型分析的檢查方法。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是 近20年來快速發(fā)展并成為臨床檢驗領(lǐng)域最富有生命力的新技術(shù)之一，該技術(shù)具有廉價、快速、檢測種類多樣的特點。由于某些染色體異常可以引起某種蛋白質(zhì)或者酶的異常，因此，通過LC-MS/MS測定羊水中某些氨基酸或肉堿的值，可能提示胎兒某些染色體異常。目前，LC-MS/MS的應(yīng)用已從食品、藥物成分分析領(lǐng)域，擴展到遺傳病的產(chǎn)前篩查中［4-5］。因此，本研究采用LC-MS/MS技術(shù)檢測羊水中氨基酸和肉堿的含量，并結(jié)合已知羊水染色體檢查結(jié)果進行樣本間比較，旨在探索新的羊水標記物，為臨床產(chǎn)前篩查提供新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

選擇2017年10月至2018年2月于我院羊水穿刺門診行超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)的孕婦1 044例。年齡17～48歲，平均（31.5±5.34）歲；孕周16周+6 d～28周，平均（20.37±4.11）周。所有研究對象均同意檢查并簽署知情同意書。根據(jù)納入標準和排除標準，最終共篩選出符合條件者513例，其中羊水檢查結(jié)果正常439例（染色體正常組），異常74例（染色體異常組）。

納入標準：處于非急性感染期，無明顯凝血功能異常；宮內(nèi)活胎；穿刺成功，標本量足夠，羊水無混血；羊水培養(yǎng)成功；具有單一的羊水穿刺指征。

排除標準：無穿刺指征而孕婦本人要求行羊膜腔穿刺術(shù)；雙胎或多胎妊娠；有高血壓、糖尿病等原發(fā)內(nèi)外科疾病；因多個穿刺指征行羊膜腔穿刺術(shù)的患者；羊水培養(yǎng)失敗。

羊水穿刺指征：唐氏篩查高風(fēng)險或臨界風(fēng)險；年齡≥35周歲；妊娠早期時接觸過可能導(dǎo)致胎兒先天缺陷的物質(zhì)；曾經(jīng)分娩過先天性嚴重缺陷嬰兒；超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常；羊水過多或者過少；胎兒頸部透明層厚度值異常；夫妻一方患有先天性疾病或遺傳性疾病，或有遺傳病家族史［6］。

1.2 研究方法

1.2.1 標本獲?。涸贐超引導(dǎo)下，避開胎兒及胎盤、臍帶等胎兒附屬組織，抽取羊水33 mL。取15 mL分裝于離心管中，2 000 r/min 離心10 min。留取上清液5 mL，置于另一無菌管中，保存于-80 ℃深凍冰箱［7］。

1.2.2 檢測方法：采用LC-MS/MS技術(shù)檢測羊水氨基酸、?；鈮A相關(guān)指標，檢測儀器為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號：Dionex3000-ABI3200 QTRAP，美國SCIEX公司）。將羊水上清液從-80 ℃深凍冰箱中取出，4 ℃下解凍，取5 μL用于串聯(lián)質(zhì)譜檢測。將羊水上清液經(jīng)含?；鈮A和氨基酸內(nèi)標的甲醇萃取，鹽酸正丁醇衍生后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，質(zhì)控標本采用美國疾控中心提供的標準濾紙片，利用已知內(nèi)標的濃度計算出所測氨基酸及酰基肉堿濃度［8］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，染色體正常組與異常組分類比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

25個氨基酸指標和39個?；鈮A指標中，染色體細胞培養(yǎng)及核型分析結(jié)果正常組和異常組（包括21三體、18三體、染色體平衡易位等）比較，Gly/Phe、C4-OH、C6：1、C16-OH、C3/C2這5項指標的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其余59項指標組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

產(chǎn)前篩查有多種方法，包括生物化學(xué)、影像學(xué)、細胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)方法，各檢查方法間相輔相成，可綜合評估胎兒在宮內(nèi)的發(fā)育情況，從而對先天性胎兒缺陷提前進行預(yù)判，為胎兒的處置方案提供依據(jù)。傳統(tǒng)的診斷方式通常為影像學(xué)結(jié)合實驗室生化或遺傳相關(guān)檢查結(jié)果，影像學(xué)主要包括頸部透明層厚度檢查、胎兒排畸超聲、胎兒磁共振檢查，實驗室檢查主要包括抽取孕婦的外周血進行生化檢查，計算唐氏篩查結(jié)果，或者行無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測檢查；也可以抽取孕婦的羊水行細胞學(xué)和遺傳學(xué)檢查。產(chǎn)前實驗室檢查結(jié)果可為產(chǎn)前篩查和診斷提供更多更有利的證據(jù)，結(jié)果之間相互印證，可提高診斷的準確率。

表1 染色體正常組與異常組氨基酸和肉堿測定含量的組間比較（，μmol/L）Tab.1 Comparison of amino acid and carnitine levels between normal and abnormal groups（，μmol/L）

表1 染色體正常組與異常組氨基酸和肉堿測定含量的組間比較（，μmol/L）Tab.1 Comparison of amino acid and carnitine levels between normal and abnormal groups（，μmol/L）

1）P＜0.05 vs negative result.The first 25 indexes are amino acids，and the rest are acylcarnitine.

常規(guī)產(chǎn)前羊水檢測因羊水培養(yǎng)周期較長（≥7 d），且妊娠是個動態(tài)的過程，等待結(jié)果的過程中隨時可能出現(xiàn)病情變化。而LC-MS/MS技術(shù)只需1～2 d即可獲得結(jié)果，如發(fā)現(xiàn)羊水中的氨基酸和肉堿中某些指標在某些先天異常胎兒與正常胎兒間存在差異，便可對異常胎兒做出初步評估，從而快速地為臨床處置提供輔證。LC-MS/MS技術(shù)檢測行羊膜腔穿刺術(shù)孕婦的羊水上清液，從中篩選可能造成先天性疾病的異常指標，簡單、易行、高效，能夠為胎兒宮內(nèi)狀態(tài)評估提供更多的依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，染色體檢測結(jié)果正常組和異常組在Gly/Phe、C4-OH、C6：1、C16-OH、C3/C2這5個指標間存在差異。因目前對羊水中氨基酸及?；鈮A檢測值與遺傳代謝病的聯(lián)系的研究較少，且無明確定論，因此，其預(yù)示的意義理論上可以參考已經(jīng)在臨床普遍應(yīng)用的患兒足跟血標本中的氨基酸與?；鈮A值。Gly/Phe可能與非酮性高甘氨酸血癥相關(guān)，該病是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，通常在新生兒期即出現(xiàn)臨床癥狀，存活者通常有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩、嚴重的認知障礙、難治性癲癇等［9］。C4-OH和C16-OH異常分別可能與短鏈-3-羥基CoA脫氫酶缺乏癥和長鏈-3-羥酰基CoA脫氫酶缺乏癥相關(guān)，且它們都可能與三功能蛋白酶缺乏癥發(fā)病相關(guān)。臨床上可表現(xiàn)為肝病、肺病，或二者皆有，極少數(shù)患者可累及皮膚，出現(xiàn)脂膜炎、紅色痛性皮膚結(jié)節(jié)或皮膚損害等，也可出現(xiàn)血管炎的表現(xiàn)［10］。C3/C2異?？赡芘c甲基丙二酸血癥，丙酸血癥的發(fā)生相關(guān)，主要臨床表現(xiàn)為患兒進食差、智力及運動發(fā)育落后，可合并營養(yǎng)不良、體質(zhì)量不增、抽搐、嘔吐、意識障礙、皮膚損害等［11］。而與C6：1異常相關(guān)的疾病目前尚未發(fā)現(xiàn)，仍需進一步探索［12］。

綜上所述，應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)早期篩查有高危妊娠傾向孕婦羊水中的Gly/Phe、C4-OH、C6：1、C16-OH、C3/C2具有較高的應(yīng)用價值，且該檢測方法價格低廉，效率較高，還可以多靶點同時篩查。但LC-MS/MS本身并不能作為診斷遺傳病的金標準，需要與其他檢查協(xié)同應(yīng)用，以提高診斷效能。找到胎兒染色體核型異常涉及的氨基酸或酰基肉堿的代謝指標以及代謝通路異常對于產(chǎn)前早期篩查、診斷有著重要的臨床意義。