牛佳媛，吳子怡，薛杭，李星樾，李暢，趙平

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指圍產(chǎn)期由于各種因素引起的新生兒缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）綜合征，是造成新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常及早期死亡的重要原因之一［1］。目前臨床應(yīng)用最廣泛的治療方法是亞低溫結(jié)合其他對(duì)癥治療，然而療效并不顯著［2］。七氟醚作為一種新型的吸入麻醉藥，具有誘導(dǎo)速度快，刺激性小，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于嬰幼兒全身麻醉誘導(dǎo)及術(shù)中維持。研究［3］表明，七氟醚后處理能減少神經(jīng)元損傷，發(fā)揮對(duì)新生大鼠HIBI的保護(hù)作用，但是對(duì)于大鼠運(yùn)動(dòng)活動(dòng)度、情緒等遠(yuǎn)期行為學(xué)的相關(guān)研究甚少。本研究通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)估七氟醚后處理對(duì)HIBI新生大鼠的運(yùn)動(dòng)度、情緒及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并通過檢測(cè)海馬記憶相關(guān)蛋白——腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討七氟醚后處理對(duì)HIBI新生大鼠遠(yuǎn)期行為學(xué)影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)新生7日齡SD大鼠，體質(zhì)量12～16 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪醫(yī)藥研究教育發(fā)展基地提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、缺血缺氧模型組（HI組）、七氟醚后處理組（HIS組），每組10只。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國際倫理準(zhǔn)則以及國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理與使用指南進(jìn)行，并經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（2017PS020K）。

1.2 模型制備及干預(yù)

參照ZHAO等［4］的方法制備HIBI模型：面罩吸入七氟醚維持麻醉，顯微鏡下用7-0絲線2次永久結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口且清醒后返回母鼠身邊繼續(xù)喂哺2 h，自制缺氧箱置于水浴箱中，水浴溫度為37 ℃，持續(xù)輸入8%O2+92%N2的濕化混合氣體（2 L/min）2 h。Sham組僅暴露左頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，不進(jìn)行低氧處理，其余2組均進(jìn)行缺血缺氧處理。HIS組新生大鼠HIBI后即刻吸入由30%O2+70%N2濕化混合氣體輸送的2%七氟醚30 min，Sham組、HI組吸入不含七氟醚的30%O2+70%N2濕化混合氣體30 min。

1.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

制模后28 d行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要由1個(gè)50 cm×50 cm×40 cm 的黑色箱組成，底部被劃分為16 個(gè)虛擬正方格，沿側(cè)壁格為外周格（周邊區(qū)），其余為中央格（中央?yún)^(qū)），正上方有錄像檢測(cè)系統(tǒng)并與計(jì)算機(jī)分析軟件系統(tǒng)連接。將小鼠放在正中央?yún)^(qū)，系統(tǒng)開始同步自動(dòng)記錄大鼠10 min穿越周邊區(qū)與中央?yún)^(qū)的時(shí)間、路程。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清除箱內(nèi)糞便，75%乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布擦干，避免留有氣味影響其他大鼠結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)用SMART系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)［5-6］。水迷宮為黑色壁圓形游泳池（直徑160 cm，深度60 cm），平均分為四個(gè)象限，第四象限內(nèi)距池壁邊緣 30 cm 處隱藏逃生平臺(tái)（直徑12 cm），位于水面下約1.5 cm處，水溫控制在（20±1）℃，水池上方安裝有自動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)，同步記錄大鼠在水池里的運(yùn)動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)前1 d分別將各組大鼠放入水池（不含平臺(tái)）中自由游泳90 s，使其熟悉水池環(huán)境。每天8：00行定位航行試驗(yàn)，共5 d。大鼠面向池壁，按隨機(jī)順序分別從4個(gè)象限的入水點(diǎn)將其放入水中，強(qiáng)迫其尋找水下平臺(tái)。圖像監(jiān)視系統(tǒng)自動(dòng)追蹤記錄其從入水到爬上平臺(tái)的總路程及爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃離潛伏期，如果大鼠在 90 s 內(nèi)自行找到平臺(tái)則讓其在平臺(tái)上停留 20 s，再進(jìn)行下一只大鼠實(shí)驗(yàn)；如果入水90 s 內(nèi)不能找到平臺(tái)，則將大鼠引導(dǎo)上平臺(tái)并使其停留 20 s，此時(shí)認(rèn)定其逃逸潛伏期為 90 s。每天測(cè)定 4 次，每次間隔時(shí)間至少 30 min，計(jì)算4 次逃離潛伏期時(shí)間的平均值。每次試驗(yàn)結(jié)束后將大鼠擦干后放回籠中，注意保暖，自由飲食水；每個(gè)訓(xùn)練日結(jié)束后清理水迷宮更換新水以消除嗅覺與環(huán)境因素的干擾。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d，將平臺(tái)從迷宮中移除，行空間探索實(shí)驗(yàn)：將大鼠放置于第二象限入水點(diǎn)，大鼠90 s內(nèi)游過平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)為穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.5 蛋白免疫印記檢測(cè)

大鼠完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，每組取5只大鼠，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。恒定電流電泳分離，然后以200 mV恒定電壓濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，TBST 洗膜，加入兔抗鼠BDNF多克隆抗體（1∶1 000，美國Abcam公司），4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3 次，每次10 min，山羊抗兔二抗（1∶2 000，中國中杉新橋公司）室溫孵育2 h，TBST洗膜3 次，每次10 min，ECL 發(fā)光，GADPH（1∶2 000，美國Proteintech公司）作為內(nèi)參照。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

每組取3只大鼠，4%多聚甲醛灌流，石蠟包埋，連續(xù)切片。行免疫組化染色［BDNF（1∶500，美國Abcam公司）］。每只大鼠選取2張海馬冠狀面切片，在高倍顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取CA1及CA3區(qū)3個(gè)不重疊的視野（50 μm×50 μm）進(jìn)行觀察，BDNF陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，計(jì)算BDNF陽性細(xì)胞數(shù)目，取3個(gè)視野的平均值作為BDNF的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，各組大鼠中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)總路程、糞便數(shù)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)總路程、糞便數(shù)量比較Tab.1 Comparison of the time spent in the central area，distance travelled，and number of fecal boli of rats from each group

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，與Sham組比較，HI組、HIS組大鼠潛伏期明顯延長（P＜0.05）；與HI組比較，HIS組潛伏期縮短（P＜0.05）?？臻g探索能力測(cè)試結(jié)果顯示，與Sham組比較，HI組、HIS組大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)均減少（P＜0.01）；與HI組比較，HIS組穿越次數(shù)增加（P＜0.05）。見表2。

表2 3組水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Tab.2 Results of the Morris water maze test among the three groups

2.3 3組大鼠海馬中BDNF表達(dá)比較

蛋白免疫印記結(jié)果顯示，Sham組、HI組、HIS組BDNF表達(dá)分別為1.00±0.55，0.21±0.18，0.83±0.23。與Sham組比較，HI組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與HI組比較，HIS組BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，神經(jīng)元胞質(zhì)染色為棕黃色表示BDNF陽性。Sham組、HI組、HIS組陽性神經(jīng)元數(shù)分別為：CA1區(qū)，9.06±0.98，3.78±1.31，6.33±0.60；CA3區(qū)，9.72±0.83，3.56±0.66，6.50±0.62。與Sham組比較，HI組大鼠左側(cè)海馬CA1及CA3區(qū)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（P＜0.01）；與HI組比較，HIS組左側(cè)海馬CA1及CA3區(qū)陽性神經(jīng)元數(shù)目增加（P＜0.01），與蛋白免疫印記檢測(cè)結(jié)果一致。見圖1。

3 討論

HIBI研究成功的關(guān)鍵是建立合適的缺氧缺血模型。本研究參照課題組前期實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)后的經(jīng)典Rice法［7］，將新生7 d大鼠行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并進(jìn)行缺氧處理，從而構(gòu)建了新生大鼠HIBI模型。

本課題組前期研究［4，8］表明，新生大鼠HIBI可導(dǎo)致遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙。本研究通過Morris水迷宮檢測(cè)證實(shí)，與Sham組比較，HI組逃逸潛伏期顯著延長，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。而曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了各組大鼠運(yùn)動(dòng)活動(dòng)度與焦慮情緒的變化，各組大鼠運(yùn)動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、糞便數(shù)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），表明HIBI并未導(dǎo)致大鼠成年后出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)活性降低及額外的焦慮情緒，也可以排除運(yùn)動(dòng)活性及焦慮情緒對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。

近年來，大量研究［4，9］表明異氟醚后處理能夠減輕HIBI新生大鼠腦損傷程度，并且具有長期保護(hù)作用。而同屬于吸入麻醉藥的七氟醚，目前更常用于小兒麻醉的誘導(dǎo)與維持，最新研究［3］表明七氟醚后處理同樣對(duì)HIBI新生大鼠腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，本研究通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)七氟醚后處理可以明顯改善HIBI新生大鼠遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶能力，與LAI等［10］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 各組大鼠海馬BDNF表達(dá)水平Fig.1 The expression of BDNF in the hippocampus of rats from each group

BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)中樞系統(tǒng)神經(jīng)元生長、分化及損傷修復(fù)至關(guān)重要［11］。研究表明，BDNF可誘導(dǎo)神經(jīng)元生存及成熟，增強(qiáng)突觸信息傳遞，從而有利于信息存儲(chǔ)，提高記憶及認(rèn)知功能［12-13］；空間學(xué)習(xí)記憶形成時(shí)BDNF表達(dá)水平增加，反之BDNF基因敲除則導(dǎo)致認(rèn)知功能減退［14-15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與Sham組比較，HI組大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)水平明顯降低，而七氟醚后處理可以提高BDNF表達(dá)水平，可見BDNF的表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶能力程度相關(guān)，由此推論BDNF可能在七氟醚后處理改善HIBI新生大鼠遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶能力過程中發(fā)揮一定的作用。

綜上所述，七氟醚后處理能促進(jìn)HIBI模型大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)，從而改善HIBI新生大鼠的遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果為七氟醚后處理對(duì)HIBI的保護(hù)作用及其分子機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。