吳鳳娟，林任，孟沅，魏薇，孫琦，賈麗紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

雙酚A（bisphenol A，BPA）是一種廣泛存在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可以通過(guò)胎盤屏障和血腦屏障損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)［1］。環(huán)境中BPA暴露可對(duì)孕婦妊娠結(jié)局及其胎兒發(fā)育構(gòu)成威脅［2］，近年來(lái)對(duì)BPA的研究主要集中在生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)的不良影響方面。隨著對(duì)BPA研究的深入，BPA對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響受到關(guān)注。BPA具有雌激素樣活性，是一種典型的外源性雌激素，很容易干擾腦內(nèi)雌激素的活動(dòng)而影響神經(jīng)行為的發(fā)育［3］。但BPA的神經(jīng)毒性作用機(jī)制尚不十分清楚。雌激素與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合發(fā)揮重要的神經(jīng)調(diào)控作用［4］，本研究采取孕期和哺乳期母鼠暴露于低或高劑量BPA實(shí)驗(yàn)，之后檢測(cè)子代雄鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及海馬ERα蛋白表達(dá)，探討B(tài)PA的神經(jīng)毒性及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究其有效的防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

BPA（色譜純，美國(guó)Sigma公司），無(wú)水乙醇（分析純，中國(guó)北京化工廠），Morris水迷宮記錄儀（荷蘭Noldus Information Technology公司），ERα鼠多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），GAPDH兔多克隆抗體（美國(guó)CST公司），辣根過(guò)氧化酶山羊二抗（上海愛(ài)必信生物科技有限公司），ECL試劑盒（英國(guó)GE Healthcare公司）。BPA 染毒溶液配制：準(zhǔn)確稱取適量BPA溶于無(wú)水乙醇，分別配制成0.2 g/L和2 g/L的BPA儲(chǔ)存液，使用時(shí)加入水配制成0.2 mg/L和2 mg/L BPA染毒溶液，去離子水中無(wú)水乙醇的終濃度為1%，對(duì)照組飲用僅含1%無(wú)水乙醇的去離子水。

1.2 小鼠飼養(yǎng)、分組及染毒

購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部的清潔級(jí)健康C57BL/6雌雄小鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每日晚8時(shí)按雌雄性別1∶1合籠交配，次日清晨檢查雌性小鼠陰栓，查到陰栓雌性小鼠定為妊娠第0天，孕鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。將24只孕鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（0.1%無(wú)水乙醇）、低劑量 BPA組（0.2 mg/L）和高劑量BPA組（2 mg/L），每組8只。小鼠從妊娠第6天開(kāi)始通過(guò)飲水方式進(jìn)行染毒至哺乳期結(jié)束。子代雄鼠3周齡斷乳后飲用不含BPA的水至4周齡實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 雄性仔鼠學(xué)習(xí)和記憶能力檢測(cè)

雄性仔鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，水迷宮分為4個(gè)象限，在第四象限中央放置一個(gè)直徑10 cm的平臺(tái)。小鼠訓(xùn)練期歷時(shí)5 d，每次60 s，如果小鼠在水中游泳一段時(shí)間后爬上平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留時(shí)間超過(guò)5 s，則認(rèn)為小鼠找到平臺(tái)。在第6天測(cè)試時(shí)將平臺(tái)移除，觀察并記錄60 s內(nèi)小鼠在平臺(tái)所在象限的搜索活動(dòng)。

1.4 雄性仔鼠海馬組織ERα蛋白檢測(cè)

雄性仔鼠處死后取出腦和海馬，稱量并記錄腦質(zhì)量和海馬質(zhì)量。取雄性仔鼠海馬組織置于1.5 mL EP管中，用剪刀將組織塊剪碎，在海馬組織內(nèi)加入預(yù)冷6倍體積的RIPA裂解液置于冰上進(jìn)行裂解加入海馬組織，超聲粉碎3次，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔濃度及吸光度（optical denssity，OD）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中蛋白濃度。蛋白含量半定量時(shí)使用8%的濃縮膠，使用100 V、90 min 電泳模式，電泳后把膠拿出放入PBST內(nèi)洗膠，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，后半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將膜放入BCA封閉液中封閉2 h后，孵育一抗（ERα多克隆抗體，1∶1 000；GAPDH多克隆抗體，1∶1 000），4 ℃冰箱過(guò)夜。次日，孵育與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗（稀釋濃度為1∶5 000），室溫1 h，然后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，采集圖像，并分析各產(chǎn)物OD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用各待測(cè)樣本和相應(yīng)樣本GAPDH的OD值比值（ODx/ODGAPDH）來(lái)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BPA暴露對(duì)雄性仔鼠腦質(zhì)量、海馬質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BPA暴露各組雄性仔鼠腦質(zhì)量、海馬質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組雄性仔鼠腦質(zhì)量、海馬質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of total brain weight and hippocampus weight in male offspring

2.2 各組雄性仔鼠學(xué)習(xí)和記憶能力比較

結(jié)果顯示，在迷宮訓(xùn)練中，各組雄性仔鼠隨著訓(xùn)練時(shí)間增加搜索平臺(tái)的距離和時(shí)間縮短，說(shuō)明各組仔鼠都有一定的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。與對(duì)照組比較，低劑量BPA組仔鼠搜索平臺(tái)的距離在第4、5天顯著延長(zhǎng)，而搜索平臺(tái)的時(shí)間在第5 天時(shí)顯著延長(zhǎng)（均P＜0.05）；高劑量BPA組仔鼠搜索平臺(tái)的距離和時(shí)間在第4、5 天時(shí)均顯著延長(zhǎng)（均P＜0.05）。見(jiàn)表2、表3。在第6天水迷宮測(cè)試中，與對(duì)照組比較，BPA暴露各組穿過(guò)目標(biāo)象限次數(shù)減少和在目標(biāo)象限的停留時(shí)間縮短（均P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組穿過(guò)目標(biāo)象限次數(shù)減少和在目標(biāo)象限的停留時(shí)間縮短更加明顯（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表4。

表2 各組雄性仔鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中搜索平臺(tái)的距離比較（，cm）Tab.2 The distance travelled in search of a platform for each group of male offspring in the positioning navigation experiment（，cm）

表2 各組雄性仔鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中搜索平臺(tái)的距離比較（，cm）Tab.2 The distance travelled in search of a platform for each group of male offspring in the positioning navigation experiment（，cm）

1）P＜0.05 vs control group.

表3 各組雄性仔鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中搜索平臺(tái)的時(shí)間（，s）Tab.3 The escape latency for each group of male offspring in the positioning navigation experiment（，s）

表3 各組雄性仔鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中搜索平臺(tái)的時(shí)間（，s）Tab.3 The escape latency for each group of male offspring in the positioning navigation experiment（，s）

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs 0.2 mg/L BPA group.

圖1 雄性仔鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖Fig.1 The trajectories of male offspring in the Morris water maze test

表4 各組穿過(guò)目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間的比較Tab.4 The frequency and time spent in target quadrants in Morris water maze test

2.3 各組雄性仔鼠海馬中ERα蛋白表達(dá)比較

結(jié)果顯示，對(duì)照組、低劑量 BPA 組、高劑量 BPA組海馬中ERα蛋白表達(dá)分別為1.17±0.35、0.64±0.21、0.40±0.12，與對(duì)照組比較，BPA暴露各組ERα蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與低劑量BPA組比較，高劑量BPA組ERα蛋白表達(dá)水平降低更加明顯（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 各組海馬中ERα蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of ERα protein expression in hippocampus across BPA exposures

BPA具有模擬雌激素和拮抗雄激素的作用，最近流行病學(xué)研究［5］顯示，BPA也與代謝性疾?。ǚ逝趾吞悄虿。┮约靶难芗膊∮嘘P(guān)。越來(lái)越多的研究［6］證明包括BPA在內(nèi)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物都可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙。美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)項(xiàng)目（national toxicology program，NTP）研究［7］也指出BPA對(duì)胎兒、嬰兒和兒童的腦和行為都會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。因此，神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是BPA的重要作用靶點(diǎn)。目前有關(guān)BPA對(duì)神經(jīng)行為的研究報(bào)道較少，而且BPA作用的分子機(jī)制還不清楚。

本研究中低劑量（0.2 mg/L）BPA是根據(jù)美國(guó)FDA報(bào)道的BPA每天允許暴露限量（50 μg/kg）進(jìn)行設(shè)計(jì)的［8］。在本研究的水迷宮實(shí)驗(yàn)中，孕期和哺乳期BPA暴露使低、高劑量BPA組雄性仔鼠每天到達(dá)平臺(tái)的平均距離和潛伏期表現(xiàn)出隨時(shí)間減少的趨勢(shì)，說(shuō)明低、高劑量 BPA組雄性仔鼠都有一定的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，但顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），表現(xiàn)出對(duì)目標(biāo)平臺(tái)記憶不清晰，提示孕期和哺乳期BPA 暴露導(dǎo)致雄性仔鼠產(chǎn)生了空間學(xué)習(xí)功能的障礙。

結(jié)果顯示，低、高劑量 BPA 組雄性仔鼠穿過(guò)目的象限的次數(shù)和停留的時(shí)間顯著少于對(duì)照組（P＜0.05），高劑量BPA組雄性仔鼠穿過(guò)目的象限的次數(shù)和停留的時(shí)間也顯著少于低劑量BPA組（P＜0.05），提示孕期和哺乳期BPA暴露導(dǎo)致雄性仔鼠產(chǎn)生空間記憶功能的障礙，且出現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步提示相對(duì)于空間學(xué)習(xí)功能的障礙，雄性仔鼠空間記憶功能的損傷更嚴(yán)重。

有研究［9］發(fā)現(xiàn)，C57BL/6 雄鼠灌胃BPA暴露（20 mg·kg-1·d-1）2 周，對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能產(chǎn)生損傷；還有研究［10］發(fā)現(xiàn)母鼠孕期暴露BPA（50 mg·kg-1·d-1）可損傷仔鼠的水迷宮和被動(dòng)逃避行為，該行為損傷可持續(xù)到仔鼠成年后。這可能是由于發(fā)育期接觸BPA，不僅影響腦內(nèi)雌激素合成關(guān)鍵酶芳香化酶的活性和表達(dá)，還可改變不同腦區(qū)ERα的表達(dá)，并因此放大或干擾雌激素對(duì)行為發(fā)育的調(diào)節(jié)作用［11］。此外，研究［11］也發(fā)現(xiàn)發(fā)育期大鼠BPA暴露（0.25 mg·kg-1·d-1）可明顯降低學(xué)習(xí)功能，本研究使用的 BPA劑量明顯低于上述研究，同樣出現(xiàn)了學(xué)習(xí)和記憶功能的損傷。因此，BPA 的神經(jīng)毒性作用的最低劑量及時(shí)間等問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究。

ER可介導(dǎo)雌激素參與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知等神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)功能，包括經(jīng)典的核內(nèi)受體和細(xì)胞膜表面受體，分別介導(dǎo)雌激素經(jīng)典基因組機(jī)制和非基因組作用機(jī)制，參與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知等神經(jīng)功能的保護(hù)［12-13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)，BPA暴露僅改變海馬ER信號(hào)中ERα的表達(dá)而非ERβ的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，BPA暴露各組致雄性仔鼠學(xué)習(xí)和記憶能力受損的同時(shí)，海馬組織內(nèi)ERα蛋白表達(dá)下降，而且高劑量BPA暴露使ERα蛋白下降更加明顯，說(shuō)明孕期和哺乳期BPA暴露導(dǎo)致雄性仔鼠學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，可能與海馬內(nèi)ERα表達(dá)降低有關(guān)。

研究［15］表明，在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，BPA暴露可導(dǎo)致ERαmRNA的表達(dá)下降，但ERβmRNA沒(méi)有影響。然而，也有研究［16］報(bào)道孕期BPA暴露（2、200 mg·kg-1·d-1）都沒(méi)能引起雌雄子鼠海馬區(qū)域ERα基因的表達(dá)發(fā)生顯著改變。這一研究結(jié)果與本研究不同，可能是由于暴露時(shí)間（孕期）和本研究存在差異。已有研究［17］表明海馬ERα的表達(dá)在子鼠出生后1周出現(xiàn)明顯的性別差異。在大鼠中ERα的表達(dá)在出生后第4 天出現(xiàn)峰值，隨后緩慢下降至成年期水平［18］。這種動(dòng)態(tài)的表達(dá)特征表明早期BPA暴露下調(diào)ERα的影響有可能會(huì)推遲ERα在發(fā)育早期海馬中的表達(dá)，進(jìn)而引起不同暴露時(shí)期ERα的表達(dá)變化不同。

綜上所述，孕期和哺乳期BPA（0.2 mg/L）暴露能夠損傷雄性仔鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，且不同行為的敏感性不同，對(duì)空間記憶功能的損傷更明顯。并且BPA劑量增加對(duì)子代小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷更加嚴(yán)重，這可能與BPA致海馬內(nèi)ERα蛋白表達(dá)下降有關(guān)。