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        高血壓患者血清微小RNA-150的表達水平、生物學功能及其與心肌纖維化的關系▲

        2019-10-17 11:16:34何亞州李麗娟黃彩依歐陽雅蓉傅為武王慶高
        廣西醫(yī)學 2019年17期
        關鍵詞:高血壓血清信號

        梁 珊 何亞州 李麗娟 黃彩依 歐陽雅蓉 傅為武 王慶高

        (1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院,南寧市 530001,電子郵箱:594103780@qq.com;2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科,南寧市 530023)

        高血壓可引起以血管和組織間隙纖維化為特征的心肌損傷,進而導致心肌組織硬化和心力衰竭。近年來,隨著心血管疾病的發(fā)病率及病死率逐漸升高,防治心肌纖維化對控制高血壓性心臟損害的發(fā)展及改善疾病預后具有重要意義[1-2]。人類微小RNA(microRNA,miRNA)為非編碼RNA,目前研究顯示多種RNA與心血管疾病關系密切[3],其中miRNA-150在合并心房顫動的收縮期心力衰竭患者的血小板中表達降低[4],但其在高血壓心肌纖維化病理改變中的機制尚不明確。有學者發(fā)現(xiàn),miRNA-150在高血壓患者及健康人群外周血中的表達存在差異,其與心肌梗死等心血管疾病相關[5]。本研究檢測高血壓患者血清miRNA-150水平,并對其進行生物信息學分析,旨在探討miRNA-150表達水平與高血壓患者心肌纖維化的相關性及可能機制。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選取2018年9月廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科一區(qū)收治的5例高血壓患者為觀察組,其中男性3例,女性2例,中位年齡50歲。納入標準:(1)高血壓診斷符合《中國高血壓防治指南(2009年基層版)》[6]中的標準:收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg;(2)首診為高血壓病,未服用藥物治療。排除標準:繼發(fā)性高血壓;合并肝、腎、肺等其他臟器系統(tǒng)纖維病變;患有冠心病、肢端肥大癥、糖尿病。選取同期在我院進行健康體檢的5例健康人為健康對照組。本研究獲本醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象均簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1 樣本采集:觀察組于入院當天清晨,對照組于體檢當天清晨,采集空腹外周靜脈血5 mL,室溫下靜置1 h,4℃、3 000 r/min離心10 min,取上層血清分裝至1.5 mL無RNA酶EP管中,所有樣本均置于-80℃保存?zhèn)溆茫?個月內進行檢測。

        1.2.2 試劑與儀器:RNA提取試劑盒(批號:DP501)、反轉錄試劑盒(批號:KR201)、實時熒光定量PCR反應試劑盒(批號:FP401)均購自天根生物科技有限公司;Ⅰ型膠原(批號:ml1027777-2)、Ⅲ型膠原(批號:ml1057474-2)及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白(批號:ml1057824-2)試劑盒;使用酶標儀購自美國Thermo Fisher公司(型號:1510-01209),實時熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司(型號:ABI7500)。

        1.2.3 血清miRNA-150的檢測:(1)提取血清總RNA。(2)將RNA 3′末端行加Poly(A)處理,在冰上預冷反應管(內含無RNA酶的水),根據反轉錄試劑盒說明書加入試劑至總體積20 uL,用移液器輕輕混勻反應液,室溫下1 000 r/min離心30 s后,在37℃下反應60 min,將合成的cDNA反應液置于-20℃保存。(3)根據實時熒光定量PCR反應試劑盒要求配置反應體系,然后采用PCR儀進行實時熒光定量PCR反應,反應程序按照預變性95℃ 2 min,PCR反應95℃ 20 s,62℃ 34 s,共進行40個循環(huán)擴增。采用GraphPad 6.2軟件進行分析,根據2-△△CT公式計算出各樣品的目的基因相對表達水平。其中以U6為內參基因,內參及目的基因引物序列見表1。實驗步驟均嚴格按照試劑盒及儀器說明書進行操作。

        表1 上游引物序列

        1.2.4 血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA水平檢測:采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA,嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作,使用酶標儀測定樣本在450 nm波長處的吸光度,根據標準品吸光度值及濃度繪制標準曲線,根據曲線方程換算成樣本蛋白濃度,每個樣本重復測量兩次,結果取平均值,結果采用GraphPad 6.2軟件進行分析。

        1.2.5 miRNA-150生物信息學分析:在TargetScanHuman 7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRWalk3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)數(shù)據庫檢索miRNA-150靶基因。利用網頁工具Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對上述3個數(shù)據庫檢索出的靶基因進行取交集處理。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據庫(https://david.ncifcrf.gov/)的基因功能分類工具(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)及功能注釋工具(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)和KOBAS 3.0網頁工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php),對此基因集進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,按P值大小從小到大排序,P值越小,富集程度越高。

        1.3 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad 6.2軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 兩組血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA水平比較 與健康人相比,觀察組患者的血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平均升高(均P>0.05),見表2。

        表2 兩組血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平比較(x±s,pg/mL)

        2.2 兩組血清miRNA-150的表達水平比較 觀察組患者miRNA-150相對表達水平為0.77±0.05,低于健康對照組的1.46±0.18(t=8.618,P<0.001)。

        2.3 miRNA-150靶基因預測結果 利用TargetScanHuman 7.1、miRWalk3.0、miRDB數(shù)據庫分別檢索到351個、2204個、380個靶基因,取交集后得到30個共同靶基因,包括ZEB1、ACBD3、RAD23B、CTNNB1、NR1D2、CERS3、METAP1、PPP2R4、DCAF6、CDK13、FAM134C、MBTD1、ELOVL1、UBFD1、 POM121C、BASP1、ACTR1A、WDR5B、PAPPA、EGR2、GOSR1、PRICKLE2、ETF1、CBL、SP1、CALU、ENSA、ADIPOR2、PRRT2、 KLHL3。

        2.4 miRNA-150靶基因的GO功能富集分析結果 所獲靶基因主要富集于脂筏特征蛋白復合物、細胞質、蛋白質-DNA復合物、核膜等細胞組分,與轉錄調控區(qū)DNA結合、轉錄因子活性、序列特異性DNA結合、鋅離子結合等分子功能有關,涉及妊娠、轉錄的正負調節(jié)等生物過程。見表3。

        表3 miRNA-150靶基因的GO功能

        注:*基因比例為涉及靶基因數(shù)量占當前功能類別識別基因總數(shù)的百分比。

        2.5 miRNA-150靶基因KEGG信號通路富集分析結果 miRNA-150靶基因富集于50條通路,取P<0.05后篩選出15條信號通路,其中涉及上皮細胞侵入、Wnt信號通路、多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程,見表4。

        表4 miRNA-150靶基因KEGG通路富集分析結果

        3 討 論

        高血壓心肌纖維化是由持續(xù)的壓力超負荷引起的心肌纖維化改變,是高血壓性心臟病心肌重構的主要病理特征,病理上表現(xiàn)為心肌成纖維細胞異常增殖、細胞外基質病理性積聚,體現(xiàn)為膠原沉積增多、比例失調(Ⅰ型、Ⅲ型膠原比例增加)和排列紊亂[7]。此外,近年來有研究表明,α-SMA可作為心肌成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞的標志物[8-9]。另有學者發(fā)現(xiàn),與同源正常血壓大鼠相比,自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈壓及心肌中膠原沉積均顯著升高[10]。本研究結果亦顯示,高血壓患者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平均高于健康對照者(P<0.05),這提示高血壓患者可能合并心肌纖維化。miRNA為由18~25個核苷酸構成的內源性非編碼RNA。有研究顯示,miRNA-150在患有心房顫動的收縮期心力衰竭患者的血小板中表達降低[4]。此外,Deng等[11]發(fā)現(xiàn),miRNA-150能通過調節(jié)轉錄因子c-Myb而影響壓力超負荷引起的心肌纖維化。本研究中,與健康對照者比較,高血壓患者血清miRNA-150表達下調(P<0.05)。由此可推測,miRNA-150下調可能與高血壓患者發(fā)生心肌纖維化相關。

        鋅離子與心肌纖維化關系密切,其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是與變性、降解纖維膠原和細胞外基質的其他組分相關的含鋅酶家族[12]。研究表明,抑制MMP可調節(jié)細胞外基質重塑和心臟衰竭的進展[13]。此外,去氧腎上腺素誘導的復合物1轉錄因子為鋅指蛋白中的一員,其能通過半胱氨酸和組氨酸來結合鋅離子,形成“鋅指結構”而識別及結合DNA,其還參與調節(jié)心臟纖維化和細胞外基質轉化,并影響MMP-9基因的表達[14]。本研究的生物信息學分析結果顯示,miRNA-150靶基因與鋅離子結合有關,這進一步反映了miRNA-150靶基因與高血壓患者發(fā)生心肌纖維化密切相關。

        Wnt信號通路與細胞生長、增殖和凋亡等生物學功能相關,其中Wnt對心肌成纖維化細胞的激活,細胞外基質的沉積,以及心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展,均有重要作用,且Wnt/β-連環(huán)蛋白經典信號通路尤為重要[15],Xiang等[16]研究發(fā)現(xiàn),小鼠心肌成纖維細胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的活化以及β-連環(huán)蛋白的激活,均對分泌胞外基質的基因表達具有重要作用,雖然沉默β-連環(huán)蛋白不改變體內活化或分化的心肌成纖維細胞數(shù)量,但其對保留壓力超負荷小鼠的心臟功能,減少心臟間質纖維化具有積極意義。還有學者發(fā)現(xiàn),通過上調Axin2和Wnt3a以激活經典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路,可誘導小鼠心肌成纖維細胞增殖,并影響MMP-13基因的表達以及MMP-2和MMP-9的酶活性,加速細胞胞外膠質重塑[17]。此外,Wnt信號通路在心肌纖維化機制中作用復雜,與多條心肌纖維化相關信號通路如轉化生長因子β通路等相互串聯(lián)[18]。而本研究中,KEGG信號通路分析提示miRNA-150的靶基因涉及Wnt信號通路,提示miRNA-150可能通過調節(jié)Wnt信號通路參與高血壓心肌纖維化的發(fā)生。

        綜上所述,高血壓患者血清miRNA-150表達下調,這可能通過調節(jié)Wnt信號通路參與了心肌纖維化的發(fā)生。但由于本研究樣本量的限制與生物信息學分析的局限性,仍需擴大樣本量進行進一步研究,并利用體外實驗對miRNA-150進行抑制或過表達,配合免疫印跡法及熒光定量實驗對通路蛋白及基因進一步驗證,以期為高血壓心肌纖維化機制的研究及疾病防治提供參考依據。

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