梁 珊 何亞州 李麗娟 黃彩依 歐陽雅蓉 傅為武 王慶高

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530001，電子郵箱：594103780@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科，南寧市 530023)

高血壓可引起以血管和組織間隙纖維化為特征的心肌損傷，進而導致心肌組織硬化和心力衰竭。近年來，隨著心血管疾病的發(fā)病率及病死率逐漸升高，防治心肌纖維化對控制高血壓性心臟損害的發(fā)展及改善疾病預后具有重要意義[1-2]。人類微小RNA(microRNA，miRNA)為非編碼RNA，目前研究顯示多種RNA與心血管疾病關系密切[3]，其中miRNA-150在合并心房顫動的收縮期心力衰竭患者的血小板中表達降低[4]，但其在高血壓心肌纖維化病理改變中的機制尚不明確。有學者發(fā)現(xiàn)，miRNA-150在高血壓患者及健康人群外周血中的表達存在差異，其與心肌梗死等心血管疾病相關[5]。本研究檢測高血壓患者血清miRNA-150水平，并對其進行生物信息學分析，旨在探討miRNA-150表達水平與高血壓患者心肌纖維化的相關性及可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年9月廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科一區(qū)收治的5例高血壓患者為觀察組，其中男性3例，女性2例，中位年齡50歲。納入標準：(1)高血壓診斷符合《中國高血壓防治指南(2009年基層版)》[6]中的標準：收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg；(2)首診為高血壓病，未服用藥物治療。排除標準：繼發(fā)性高血壓；合并肝、腎、肺等其他臟器系統(tǒng)纖維病變；患有冠心病、肢端肥大癥、糖尿病。選取同期在我院進行健康體檢的5例健康人為健康對照組。本研究獲本醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：觀察組于入院當天清晨，對照組于體檢當天清晨，采集空腹外周靜脈血5 mL，室溫下靜置1 h，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清分裝至1.5 mL無RNA酶EP管中，所有樣本均置于-80℃保存?zhèn)溆茫?個月內進行檢測。

1.2.2 試劑與儀器：RNA提取試劑盒(批號：DP501)、反轉錄試劑盒(批號：KR201)、實時熒光定量PCR反應試劑盒(批號：FP401)均購自天根生物科技有限公司；Ⅰ型膠原(批號：ml1027777-2)、Ⅲ型膠原(批號：ml1057474-2)及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)蛋白(批號：ml1057824-2)試劑盒；使用酶標儀購自美國Thermo Fisher公司(型號：1510-01209)，實時熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司(型號：ABI7500)。

1.2.3 血清miRNA-150的檢測：(1)提取血清總RNA。(2)將RNA 3′末端行加Poly(A)處理，在冰上預冷反應管(內含無RNA酶的水)，根據反轉錄試劑盒說明書加入試劑至總體積20 uL，用移液器輕輕混勻反應液，室溫下1 000 r/min離心30 s后，在37℃下反應60 min，將合成的cDNA反應液置于-20℃保存。(3)根據實時熒光定量PCR反應試劑盒要求配置反應體系，然后采用PCR儀進行實時熒光定量PCR反應，反應程序按照預變性95℃ 2 min，PCR反應95℃ 20 s，62℃ 34 s，共進行40個循環(huán)擴增。采用GraphPad 6.2軟件進行分析，根據2-△△CT公式計算出各樣品的目的基因相對表達水平。其中以U6為內參基因，內參及目的基因引物序列見表1。實驗步驟均嚴格按照試劑盒及儀器說明書進行操作。

表1 上游引物序列

1.2.4 血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA水平檢測：采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA，嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作，使用酶標儀測定樣本在450 nm波長處的吸光度，根據標準品吸光度值及濃度繪制標準曲線，根據曲線方程換算成樣本蛋白濃度，每個樣本重復測量兩次，結果取平均值，結果采用GraphPad 6.2軟件進行分析。

1.2.5 miRNA-150生物信息學分析：在TargetScanHuman 7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRWalk3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)數(shù)據庫檢索miRNA-150靶基因。利用網頁工具Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對上述3個數(shù)據庫檢索出的靶基因進行取交集處理。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據庫(https://david.ncifcrf.gov/)的基因功能分類工具(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)及功能注釋工具(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)和KOBAS 3.0網頁工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php)，對此基因集進行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，按P值大小從小到大排序，P值越小，富集程度越高。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad 6.2軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA水平比較 與健康人相比，觀察組患者的血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平均升高(均P>0.05)，見表2。

表2 兩組血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平比較(x±s,pg/mL)

2.2 兩組血清miRNA-150的表達水平比較 觀察組患者miRNA-150相對表達水平為0.77±0.05，低于健康對照組的1.46±0.18(t=8.618，P<0.001)。

2.3 miRNA-150靶基因預測結果 利用TargetScanHuman 7.1、miRWalk3.0、miRDB數(shù)據庫分別檢索到351個、2204個、380個靶基因，取交集后得到30個共同靶基因，包括ZEB1、ACBD3、RAD23B、CTNNB1、NR1D2、CERS3、METAP1、PPP2R4、DCAF6、CDK13、FAM134C、MBTD1、ELOVL1、UBFD1、 POM121C、BASP1、ACTR1A、WDR5B、PAPPA、EGR2、GOSR1、PRICKLE2、ETF1、CBL、SP1、CALU、ENSA、ADIPOR2、PRRT2、 KLHL3。

2.4 miRNA-150靶基因的GO功能富集分析結果 所獲靶基因主要富集于脂筏特征蛋白復合物、細胞質、蛋白質-DNA復合物、核膜等細胞組分，與轉錄調控區(qū)DNA結合、轉錄因子活性、序列特異性DNA結合、鋅離子結合等分子功能有關，涉及妊娠、轉錄的正負調節(jié)等生物過程。見表3。

表3 miRNA-150靶基因的GO功能

注：*基因比例為涉及靶基因數(shù)量占當前功能類別識別基因總數(shù)的百分比。

2.5 miRNA-150靶基因KEGG信號通路富集分析結果 miRNA-150靶基因富集于50條通路，取P<0.05后篩選出15條信號通路，其中涉及上皮細胞侵入、Wnt信號通路、多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，見表4。

表4 miRNA-150靶基因KEGG通路富集分析結果

3 討 論

高血壓心肌纖維化是由持續(xù)的壓力超負荷引起的心肌纖維化改變，是高血壓性心臟病心肌重構的主要病理特征，病理上表現(xiàn)為心肌成纖維細胞異常增殖、細胞外基質病理性積聚，體現(xiàn)為膠原沉積增多、比例失調(Ⅰ型、Ⅲ型膠原比例增加)和排列紊亂[7]。此外，近年來有研究表明，α-SMA可作為心肌成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞的標志物[8-9]。另有學者發(fā)現(xiàn)，與同源正常血壓大鼠相比，自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈壓及心肌中膠原沉積均顯著升高[10]。本研究結果亦顯示，高血壓患者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平均高于健康對照者(P<0.05)，這提示高血壓患者可能合并心肌纖維化。miRNA為由18～25個核苷酸構成的內源性非編碼RNA。有研究顯示，miRNA-150在患有心房顫動的收縮期心力衰竭患者的血小板中表達降低[4]。此外，Deng等[11]發(fā)現(xiàn)，miRNA-150能通過調節(jié)轉錄因子c-Myb而影響壓力超負荷引起的心肌纖維化。本研究中，與健康對照者比較，高血壓患者血清miRNA-150表達下調(P<0.05)。由此可推測，miRNA-150下調可能與高血壓患者發(fā)生心肌纖維化相關。

鋅離子與心肌纖維化關系密切，其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是與變性、降解纖維膠原和細胞外基質的其他組分相關的含鋅酶家族[12]。研究表明，抑制MMP可調節(jié)細胞外基質重塑和心臟衰竭的進展[13]。此外，去氧腎上腺素誘導的復合物1轉錄因子為鋅指蛋白中的一員，其能通過半胱氨酸和組氨酸來結合鋅離子，形成“鋅指結構”而識別及結合DNA，其還參與調節(jié)心臟纖維化和細胞外基質轉化，并影響MMP-9基因的表達[14]。本研究的生物信息學分析結果顯示，miRNA-150靶基因與鋅離子結合有關，這進一步反映了miRNA-150靶基因與高血壓患者發(fā)生心肌纖維化密切相關。

Wnt信號通路與細胞生長、增殖和凋亡等生物學功能相關，其中Wnt對心肌成纖維化細胞的激活，細胞外基質的沉積，以及心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，均有重要作用，且Wnt/β-連環(huán)蛋白經典信號通路尤為重要[15]，Xiang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌成纖維細胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的活化以及β-連環(huán)蛋白的激活，均對分泌胞外基質的基因表達具有重要作用，雖然沉默β-連環(huán)蛋白不改變體內活化或分化的心肌成纖維細胞數(shù)量，但其對保留壓力超負荷小鼠的心臟功能，減少心臟間質纖維化具有積極意義。還有學者發(fā)現(xiàn)，通過上調Axin2和Wnt3a以激活經典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，可誘導小鼠心肌成纖維細胞增殖，并影響MMP-13基因的表達以及MMP-2和MMP-9的酶活性，加速細胞胞外膠質重塑[17]。此外，Wnt信號通路在心肌纖維化機制中作用復雜，與多條心肌纖維化相關信號通路如轉化生長因子β通路等相互串聯(lián)[18]。而本研究中，KEGG信號通路分析提示miRNA-150的靶基因涉及Wnt信號通路，提示miRNA-150可能通過調節(jié)Wnt信號通路參與高血壓心肌纖維化的發(fā)生。

綜上所述，高血壓患者血清miRNA-150表達下調，這可能通過調節(jié)Wnt信號通路參與了心肌纖維化的發(fā)生。但由于本研究樣本量的限制與生物信息學分析的局限性，仍需擴大樣本量進行進一步研究，并利用體外實驗對miRNA-150進行抑制或過表達，配合免疫印跡法及熒光定量實驗對通路蛋白及基因進一步驗證，以期為高血壓心肌纖維化機制的研究及疾病防治提供參考依據。