董 寧,張?zhí)锾?郭青玉,阮建平*

(1陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒童口腔科,西安 710004;2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔預(yù)防科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:ruanjp@xjtu.edu.cn)

牙體硬組織無法自我再生和重建,而牙髓組織具有一定的修復(fù)和再生潛能[1],調(diào)控牙髓細(xì)胞的增殖分化從而形成修復(fù)性牙本質(zhì)對(duì)于發(fā)展新的牙髓再生治療方法有著重要的意義。然而,牙齒發(fā)育過程以及組織損傷后牙髓細(xì)胞(dental pulp cells,DPCs)的應(yīng)答和修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,涉及到多種生物學(xué)過程,包括基因水平、分子水平和細(xì)胞水平的各種變化和相互調(diào)控,以及多種生物分子的參與,具體的作用機(jī)制尚不明確[2]。

Lin28是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白,也是一種調(diào)控機(jī)體發(fā)育時(shí)相的異時(shí)性基因[3],Lin28可穩(wěn)定表達(dá)于胚胎組織和一些具備強(qiáng)大修復(fù)再生能力的組織中,包括心臟和骨骼肌等[4]。研究證實(shí)過表達(dá)Lin28可以使得轉(zhuǎn)基因小鼠的毛發(fā)、軟骨、皮膚以及其他軟組織在損傷后得到快速再生[5]。本課題組前期研究通過建立動(dòng)物模型,證實(shí)了Lin28參與了牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的損傷修復(fù)過程[6]。本研究通過調(diào)控Lin28基因在人牙髓細(xì)胞中過表達(dá),觀察其對(duì)牙髓細(xì)胞增殖、分化、礦化能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

1.2 人牙髓細(xì)胞(HDPCs)的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

從西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科門診收集12-22歲志愿者(知情同意)因正畸減數(shù)或阻生新鮮拔除的健康完整恒牙,無菌條件下取出牙髓,放入PBS中;將牙髓剪碎,采用酶消化法收集細(xì)胞消化,并用20%胎牛血清的DMEM重懸后,接種于35 mm培養(yǎng)皿,放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng),待細(xì)胞融合率達(dá)80%后傳代培養(yǎng),取生長良好的第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

用含10%的胎牛血清,抗生素,50 ng/ml維生素C,10 mmol/ml β-甘油磷酸鈉和4 ng/ml地塞米松的DMEM作為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。隨機(jī)將HDPCs分成3個(gè)組:未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HDPCs(正常組);轉(zhuǎn)染空載體的HDPCs(NT組);過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染的HDPCs(Lin28組)。培養(yǎng)至待測時(shí)間時(shí),分別進(jìn)行細(xì)胞增殖、分化和相關(guān)基因的檢測。

1.3 Lin28慢病毒轉(zhuǎn)染

采用慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建攜帶目的基因Lin28和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的慢病毒載體LV-Lin28-EGFP,熒光倒置顯微鏡下篩選最適感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為200轉(zhuǎn)染DPCs。將細(xì)胞接種在6孔板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)至24 h加入不同濃度梯度的嘌呤霉素進(jìn)行致死濃度實(shí)驗(yàn),選擇能使細(xì)胞全部死亡的最低濃度作為嘌呤霉素的最佳篩選濃度,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定0.5 ng/ml作為嘌呤霉素最佳篩選濃度。維持嘌呤霉素濃度,隔天換液,觀察。連續(xù)4 d,至正常細(xì)胞全部死亡后,認(rèn)為已經(jīng)獲得穩(wěn)篩株。穩(wěn)篩株細(xì)胞分別在培養(yǎng)72 h和96 h時(shí)收集,用于RT-PCR、Western blot檢測Lin28轉(zhuǎn)染結(jié)果。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性

取第3代HDPCs,按前述分組以5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度等量接種于96孔培養(yǎng)板,分別培養(yǎng)1,3,5,7 d,采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。按說明操作后,酶標(biāo)儀450 nm波長下測定各孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以只含有培養(yǎng)基和CCK-8試劑的孔作為空白對(duì)照。

1.5 生物化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)水平

細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板,并設(shè)置空培養(yǎng)基孔作為對(duì)照,待細(xì)胞鋪滿率達(dá)到80%時(shí)加入裂解液冰上裂解細(xì)胞,低溫離心后取蛋白上清,依據(jù)ATP檢測試劑盒產(chǎn)品說明在檢測孔中加入相應(yīng)的工作液、標(biāo)準(zhǔn)品及Lin28過表達(dá)組及空白對(duì)照組樣品,靜置2 s,用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度,換算成nmol/mg蛋白的形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 堿性磷酸酶(ALP)活性測定

各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至7,14 d時(shí)加入細(xì)胞裂解液,使用堿性磷酸酶活性測定試劑盒檢測ALP活性。加入工作液,37 ℃孵育10 min。終止反應(yīng)后,用酶標(biāo)儀在405 nm測定吸光度。ALP(U/mg)活性定義為1 mol對(duì)硝基苯酚每毫克細(xì)胞總蛋白的釋放量。

1.7 茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié)形成

上述實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞,加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液分別礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)14,21 d,用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。細(xì)胞清洗3次,固定液固定30 min,加入適量無菌茜素紅,37 ℃溫育30 min,吸掉茜素紅用清洗液清洗3次,觀察并拍照。

然而，近年來國產(chǎn)陶瓷在國際市場上一直保持著數(shù)量上（我國日用陶瓷總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的65%～70%）的大國地位，但從總體水平上看是大而不強(qiáng)（出口日用陶瓷平均單件換匯僅為0.21 美元，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于世界平均單件出口價(jià)格1 美元以上的水平，為英國、日本的 1/7，法國的 1/3），與國際先進(jìn)水平相比還有較大的差距。隨著我國物質(zhì)生活和文化生活的不斷發(fā)展提高，人們對(duì)高檔有品質(zhì)的日用陶瓷產(chǎn)品的需求也大大地提高了，這無疑給我過日用陶瓷產(chǎn)品發(fā)展帶來了新的發(fā)展空間和契機(jī)，同時(shí)也對(duì)我國日用陶瓷產(chǎn)品設(shè)計(jì)提出了新的挑戰(zhàn)和更新更高的要求。

1.8 qRT-PCR檢測牙本質(zhì)形成相關(guān)基因mRNA表達(dá)

檢測過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染人牙髓細(xì)胞后Lin28 mRNA的表達(dá)情況。同時(shí)上述三組細(xì)胞礦化誘導(dǎo)1,7,14 d,觀察各組細(xì)胞中牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP-1)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的mRNA表達(dá)情況。按試劑盒操作說明提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進(jìn)行熒光定量PCR檢測。使用的引物序列見表1。以ACTB表達(dá)水平作為內(nèi)參,通過檢測目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)變化進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列表

Table 1 Sequences of primers

基因序列(5′-3′) 長度(bp)Lin28正向:TATTGGGAGTGAGAGGCGGC21反向:TTGCATTCCTTGGCATGATGAT21DSPP正向:CCAGGGACAAGTAAGCATCA20反向:GACAACAGCGACATCCTCATT21OCN正向:CACACTCCTCGCCCTATTG19反向:CGCCTGGGTCTCTTCACTAC20OPN正向:GCCGTGGGAAGGACAGTTAT20反向:GCTCATTGCTCTCATCATTGG21DMP-1正向:AAGAGGTGGTGAGTGAGTCCA21反向:TTGAGTGGGAGAGTGTGTGC20ALP正向:TACAACACCAATGCCCAGGT20反向:ACAGATTTCCCAGCGTCCTT20ACTB正向:CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAGC23反向:CCAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG22

1.9 Western blot檢測Lin28蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)的Lin28蛋白表達(dá)情況。使用BCA蛋白分析試劑盒(Thermo Fisher Scientific,美國)測定蛋白濃度。蛋白分離然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(Millipore,美國)。封閉后,用鼠抗人一抗Lin28(1 ∶1 000,Abcam,美國)孵育。洗滌后,用羊抗鼠IgG(1 ∶5 000,全式金,中國)孵育。最后洗滌,化學(xué)發(fā)光檢測后使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HDPCs中Lin28的穩(wěn)定過表達(dá)

分別用qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染72 h和96 h的細(xì)胞樣本,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和空載體組相比,過表達(dá)組Lin28 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見圖1)。

2.2 Lin28過表達(dá)對(duì)HDPCs增殖活性的影響

CCK-8法增殖活性檢測結(jié)果顯示,三組的OD值隨著時(shí)間變化均呈現(xiàn)上升趨勢,檢測第1天未見明顯差異;而自第3天起,Lin28過表達(dá)牙髓細(xì)胞組的OD值明顯高于正常牙髓細(xì)胞組和空載體轉(zhuǎn)染組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。空載體組和正常牙髓細(xì)胞組間的差異沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與正常組和空載體組相比,*P<0.05圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染HDPCs后Lin28的表達(dá)情況Figure 1 Expression of Lin28 in HDPCs after transfected by lentivirus

與正常組和空載體組相比,*P<0.05圖2 Lin28過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活性影響Figure 2 Effect of Lin28 overexpression on cell proliferation

2.3 Lin28過表達(dá)對(duì)HDPCs ATP活性的影響

三組細(xì)胞接種培養(yǎng)72 h,收集進(jìn)行ATP水平的檢測,化學(xué)發(fā)光后酶標(biāo)儀檢測得出ATP濃度,結(jié)果見圖3。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,與空白組和空載體組比較,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ATP水平較高(P<0.05),空載體組ATP水平與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 Lin28過表達(dá)對(duì)HDPCs堿性磷酸酶活性的影響

對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行礦化誘導(dǎo),分別在7,14 d行堿性磷酸酶(ALP)活性測定,結(jié)果顯示,Lin28過表達(dá)牙髓細(xì)胞各時(shí)間段ALP活性均較空載體轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞組和正常牙髓細(xì)胞組明顯升高(P<0.05);而空載體轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞組和正常牙髓細(xì)胞組的ALP活性差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖4)。

A.ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線 B.細(xì)胞ATP水平測定結(jié)果圖3 Lin28過表達(dá)對(duì)細(xì)胞ATP水平影響Figure 3 Effect of Lin28 overexpression on ATP level

與正常組和空載體組相比,*P<0.05圖4 Lin28過表達(dá)對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性影響Figure 4 Effect of Lin28 overexpression on ALP activity

2.5 Lin28過表達(dá)對(duì)HDPCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

分別在14 d和21 d用茜素紅染色觀察各組礦化結(jié)節(jié)的形成情況,結(jié)果顯示:三組均形成不同程度的桔紅色礦化結(jié)節(jié),14 d和21 d時(shí),Lin28慢病毒轉(zhuǎn)染組牙髓細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出空載體組和正常組,而空載體轉(zhuǎn)染組和正常牙髓細(xì)胞之間的礦化結(jié)節(jié)形成程度無明顯差別(見圖5)。

圖5 Lin28過表達(dá)對(duì)HDPCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響(茜素紅染色)Figure 5 Effect of Lin28 overexpression on calcified nodules in HDPCs by Alizarin red staining

2.6 Lin28過表達(dá)對(duì)牙本質(zhì)形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

穩(wěn)定表達(dá)Lin28后,人牙髓細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)均較正常組和空載體組呈現(xiàn)上升趨勢。其中,DSPP、DMP-1、OCN、OPN mRNA的表達(dá)量均較轉(zhuǎn)染空載體牙髓細(xì)胞和正常牙髓細(xì)胞表達(dá)上調(diào)(P<0.05),14 d時(shí)過表達(dá)組較正常組和空載體組表達(dá)量的差異最為明顯,而轉(zhuǎn)染空載體的牙髓細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞相比各成骨相關(guān)基因的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖6)。Lin28過表達(dá)組ALP mRNA在1 d時(shí)的表達(dá)與轉(zhuǎn)染空載體的牙髓細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但在7 d和14 d時(shí)呈明顯增高趨勢,與正常組和空載體組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

與正常組和空載體組相比,*P<0.05;與正常組比較，#P<0.05圖6 Lin28過表達(dá)對(duì)成牙本質(zhì)相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Figure 6 Effect of Lin28 overexpression on expression of odontoblast-related genes

3 討論

牙髓細(xì)胞修復(fù)再生的研究長期以來備受學(xué)者關(guān)注,牙髓細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞被證實(shí)有較強(qiáng)的克隆增殖能力和多向分化潛能[7,8]。牙髓細(xì)胞在體外礦化誘導(dǎo)下,具有向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力。這些能力使牙髓細(xì)胞不僅用于研究牙齒再生,也是骨組織等多重器官再生研究的重要模式細(xì)胞之一[9],而與之密切關(guān)聯(lián)的基因也被陸續(xù)發(fā)掘出來,其中多數(shù)具有調(diào)控作用的因子屬于干細(xì)胞調(diào)控因子和信號(hào)通路分子[10,11]。

Lin28被證實(shí)能增強(qiáng)多種細(xì)胞的增殖活性,并能讓胚胎干細(xì)胞維持多能性。在線蟲中過表達(dá)Lin28發(fā)現(xiàn)幼蟲的青春期被延長,延緩了成熟時(shí)間。近年來國內(nèi)外多項(xiàng)涉及轉(zhuǎn)基因小鼠模型及體外肌肉、神經(jīng)等各種組織細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究,均證實(shí)了適度提升Lin28的表達(dá)水平會(huì)有效提高細(xì)胞的增殖活性和器官的代謝水平,有利于組織修復(fù)再生[12,13]。這些特點(diǎn)賦予了Lin28“青春基因”的美譽(yù)[14]。正常情況下,Lin28高表達(dá)于胚胎組織細(xì)胞,隨著器官發(fā)育和細(xì)胞分化，其表達(dá)逐漸沉默,不再具備明顯的調(diào)控功能。此外,Lin28亦被認(rèn)為是一種“致癌基因”,包括畸胎瘤和生殖、消化系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了Lin28的異常高表達(dá)[15,16]。因此如何控制Lin28的表達(dá)含量而不至于引起組織和細(xì)胞惡性增殖也關(guān)系到Lin28的功能性應(yīng)用。研究顯示[5],“再喚醒”生命體內(nèi)的Lin28適度過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞代謝水平,加速小鼠表皮和軟骨的損傷修復(fù)過程。而聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)包括Lin28在內(nèi)的各種“干性”基因,能夠重組體細(xì)胞,重新賦予體細(xì)胞“多能性”[17]。這提示我們通過誘導(dǎo)激活或者外源性轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法提高Lin28的持續(xù)表達(dá)水平,可能會(huì)改變牙髓組織和細(xì)胞的修復(fù)再生能力。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Lin28參與了牙胚正常發(fā)育[18]及牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體損傷修復(fù)過程[6],在此基礎(chǔ)上,本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察了Lin28過表達(dá)后對(duì)牙髓細(xì)胞的影響。我們利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染,使得牙髓細(xì)胞穩(wěn)定、持續(xù)、高效表達(dá)Lin28基因。隨后通過增殖、細(xì)胞能量、分化、礦化相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定過表達(dá)Lin28的牙髓細(xì)胞增殖水平明顯高于正常牙髓細(xì)胞,證明了Lin28同樣具備促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖活性的能力。有研究發(fā)現(xiàn)牙髓組織內(nèi)壓力增大時(shí),牙髓細(xì)胞會(huì)釋放三磷酸腺苷(ATP),從而增強(qiáng)細(xì)胞活性并調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Lin28能提高牙髓細(xì)胞的ATP活性,提示我們調(diào)控細(xì)胞能量和氧化磷酸化可能是Lin28的主要功能之一。同時(shí),經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后Lin28過表達(dá)的牙髓細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)的水平均高于其他組,說明Lin28對(duì)牙髓細(xì)胞的分化也有促進(jìn)作用。此外,過表達(dá)Lin28組在誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d和21 d的礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量和范圍都顯著高于其他組,實(shí)驗(yàn)證明,穩(wěn)定表達(dá)Lin28可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的成牙能力,并促進(jìn)了牙本質(zhì)基質(zhì)的形成。

牙髓細(xì)胞的修復(fù)再生能力是通過一系列交互反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的,包括增殖、趨化和向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化,從而促使修復(fù)性牙本質(zhì)形成[2]。因此牙髓組織中已分化和未分化的細(xì)胞均會(huì)參與到牙本質(zhì)再生過程中[20]。而成牙本質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌許多膠原蛋白和非膠原蛋白,包括骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein-1,DMP-1)和牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)等。這些分子都是衡量牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的礦化標(biāo)記物[21]。本研究中,人牙髓細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Lin28后,礦化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯上升。說明Lin28可能通過調(diào)控人牙髓細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)來影響成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化和礦化基質(zhì)的合成。

本研究通過一系列細(xì)胞表型研究,證實(shí)了Lin28對(duì)于牙髓細(xì)胞的正向調(diào)控作用,實(shí)驗(yàn)證明Lin28能夠提升人牙髓細(xì)胞的活性及能量代謝水平,從而可能有利于牙髓組織的修復(fù)和再生。但是具體的調(diào)控方式仍有待于深入研究驗(yàn)證,同時(shí)需要各項(xiàng)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)揭示Lin28在牙髓組織中的亞細(xì)胞定位變化及基因結(jié)合位點(diǎn),以觀察證實(shí)Lin28在牙髓損傷修復(fù)過程中細(xì)胞遷移方向和參與程度。