張藝軍 鄒瑞 鐘武裝 蔡敏捷 許桂英 樂德 劉崗

(1中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房二科，廣東 廣州 510010；2廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 廣州口腔疾病研究所 口腔醫(yī)學重點實驗室)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作為一種代謝性肝損傷性疾病，其發(fā)病率正在逐年上升。長期NASH可以進一步進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，然而其發(fā)病機制目前尚不明確，也缺乏有效的預防措施。胰島素抵抗是公認的產(chǎn)生NASH的重要環(huán)節(jié)。研究提示，血管緊張素(Ang)(1～7)能在一定程度上改善細胞胰島素抵抗狀態(tài)，從而抑制NASH的進展〔1〕。但Ang(1～7)與胰島素受體底物(IRS)1/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲/蘇氨酸激酶(Akt)胰島素信號通路之間的調(diào)控關系還尚未見系統(tǒng)研究。本研究擬分析IRS1/PI3K/Akt信號通路在Ang(1～7)調(diào)節(jié)NASH中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(GIBCO，美國)，胰蛋白酶(Sigma，美國)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，美國)，油酸(賽哲生物，廣州),二甲基亞砜(DMSO，賽哲生物，廣州)，油紅(賽哲生物，廣州)，Ang(1～7)(PhoenixBiotech,德國)，AngⅡ(Sigma，美國)，A779(晶欣，深圳)，總膽固醇試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α購自CUSABIO(武漢)，AKT1(AF0836)、PI3K抑制劑(AF6241)、兔PI3-kinase(AF6241)、兔IRS1(AF6273)及多克隆抗IRS1抗體購自美國AFFINITY公司 ，人肝細胞L02細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2NASH體外模型建立 L02細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入20 mg/ml油酸(以0.5%DMSO溶解)誘導肝細胞脂肪變性，隔天換液并加入新配制的油酸。分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板，72 h后細胞發(fā)生脂肪變。光鏡觀察細胞內(nèi)脂肪油紅染色情況。

1.3實驗分組 將細胞加入培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，細胞分為陰性對照組、Ang(1～7)處理組、AngⅡ處理組、Ang(1～7)+A779處理組，每組細胞數(shù)約5×106個。對照組為脂肪變肝細胞，未加任何干預因素。處理組分別加入10-6mol/L Ang(1～7)，10-6mol/L Ang(1～7)和10-6mol/L MAS拮抗劑(A779)共同干預及10-6mol/L AngⅡ干預。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取細胞上清液進行檢測。每組分別重復3次測量。

1.4檢測各組細胞上清液中TNF-α、ALT、總膽固醇、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)含量 將細胞接種于6孔板中，待細胞完全貼壁生長至60%～80%融合時，分別加入10-6mol/L Ang(1～7)，10-6mol/L AngⅡ及10-6mol/L Ang(1～7)和 10-6mol/L MAS拮抗劑(A779)共同干預，對照組不加任何試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再收集細胞的上清液。按照說明書操作步驟進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，檢測各組細胞上清液中TNF-α、ALT、總膽固醇、GULT4的含量。

1.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IRS1 mRNA表達 總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,引物設計為β-actin上游引物：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，下游引物：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。IRS1上游引物：5′-AAGCACCTATGCCAGCATCAAC-3′，下游引物:5′-GAGGATTGCTGAGGTCATTTAGGTC-3′。RT 和PCR體系均為25 μl。反應條件:95℃ 變性 30 s,60℃ 退火60 s,72℃ 延伸15 s,40個循環(huán)。 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,EPSON Perfection 2480 Photo掃描儀(愛普生公司產(chǎn)品)掃描條帶,SmartView 2000生物電泳圖像分析軟件(上海復日科技有限公司產(chǎn)品)對條帶密度進行密度定量分析,與標準化的β-actin條帶密度掃描值作對比后測定其表達情況。

1.6Western印跡檢測PI3K及Akt蛋白表達 取30 μg蛋白上樣，10%分離膠和5%濃縮膠電泳。350 mA進行恒流電轉(zhuǎn)移。一抗封閉后過夜，再二抗孵育1 h。洗膜后置暗室中，等體積混合發(fā)光緩沖液A與B，均勻滴加到聚偏氟乙烯(PVDF)膜的蛋白面上。壓X光膠片1～10 min，顯影后定影，Gel-ProAnalyzer分析蛋白條帶的灰度值。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1脂肪變肝細胞的構(gòu)建 脂肪變肝L02細胞經(jīng)油紅O染色后，可見大量脂質(zhì)集聚的紅染顆粒積聚，見圖1。

2.2各組總膽固醇、ALT、GLUT4的變化情況 Ang(1～7)組總膽固醇、ALT含量顯著低于陰性對照組，GLUT4含量顯著高于陰性對照組(P<0.05)。AngⅡ組、Ang(1～7)+A779組總膽固醇、ALT、GLUT4含量與陰性對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3各組IRS1基因活性、磷酸化(p)-PI3K、Akt及TNF-α的表達變化 Ang(1～7)組IRS1基因活性增強，p-PI3K、p-Akt表達水平升高，TNF-α表達量下降，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AngⅡ組與Ang(1～7)+A779組IRS1基因活性減弱，p-PI3K、p-Akt表達水平下降，AngⅡ組TNF-α表達量升高，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 經(jīng)油紅染色的NASH細胞模型(×400)

表1 各組細胞培養(yǎng)上清液中ALT、總膽固醇、GLUT4水平比較

與陰性對照組比較：1)P<0.05；下表同

表2 各組IRS1、p-PI3K、p-Akt、TNF-α表達量比較

3 討 論

NASH正成為全球最常見的慢性肝病，其患病率為20%～30%，在一些特殊人群中其患病率更高，據(jù)統(tǒng)計，2型糖尿病患者中有70%合并該病，而在肥胖者中其患病率高達90%〔2〕,NASH的發(fā)病機制復雜〔3,4〕。2004年，Wang等〔5〕首次提出胰島素抵抗的定義，并認為胰島素信號傳遞受阻或減弱，是導致胰島素抵抗的主要原因。胰島素抵抗可減弱和破壞胰島素對脂肪代謝的調(diào)節(jié)，增加脂質(zhì)溶解，提高循環(huán)中游離脂肪酸濃度，促進肝臟游離脂肪酸的攝取和肝細胞內(nèi)三酰甘油的合成，促使三酰甘油在肝細胞內(nèi)蓄積，導致NASH的形成〔6〕。Promrat 等〔7〕發(fā)現(xiàn)胰島素增敏劑可使NASH患者的生化指標和肝臟組織學特征獲得改善。迄今，胰島素抵抗被公認為NASH的核心機制。NASH發(fā)病機制的“二次打擊”假說〔8〕認為，脂肪蓄積通過脂毒性作用，誘導過氧化作用、氧化應激、炎癥、細胞凋亡、纖維化等二次打擊的發(fā)生。脂肪組織(尤其是內(nèi)臟性脂肪)的增加伴隨胰島素增敏因子、抗炎因子的減少及致炎因子的增加，炎癥因子反過來通過調(diào)節(jié)脂肪細胞分泌代謝而增強胰島素抵抗。 Najjar等〔9〕證明，單核細胞趨化蛋白(MCP)-1通過募集巨噬細胞在脂肪組織中產(chǎn)生炎癥，加重脂肪肝和胰島素抵抗。在動物模型和NASH患者中，肝臟核因子(NF)-κB表達顯著增加，活化的NF-κB通過上調(diào)白細胞介素(IL)-6、TNF-α等水平介導肝臟炎癥，加重胰島素抵抗。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)廣泛存在于各種組織器官。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-AngⅡ- AngⅡ 1型受體軸(AT1R)是其主要分支。多項研究證實〔10～12〕，ACE抑制劑和AngⅡ受體阻斷劑可以阻斷2型糖尿病的進展，發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用。ACE2-Ang(1～7)-MAS軸作為RAS分支，抑制ACE-AngⅡ-AT1R軸的內(nèi)在調(diào)節(jié)途徑，對多種組織器官具有保護作用〔13～15〕。Ang(1～7)在體內(nèi)外與AT1R競爭性結(jié)合，拮抗AngⅡ活性，被認為是內(nèi)源性AngⅡ的阻斷劑〔16〕。 Ang(1～7)可以完全阻斷AngⅡ?qū)δI近曲小管上皮細胞、人內(nèi)皮細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2的磷酸化作用，該阻斷作用可以被MAS受體阻斷劑A779所抑制。

本研究提示，AngⅡ能對肝細胞造成持續(xù)性損傷，Ang(1～7)有改善肝細胞功能的作用。 A779作為Ang(1～7)的拮抗劑，阻斷Ang(1～7)對肝細胞的保護作用，具有反向調(diào)節(jié)功能。GLUT4是一類嵌于細胞膜上用于轉(zhuǎn)運葡萄糖的蛋白質(zhì)載體，在機體攝取葡萄糖及代謝葡萄糖過程中發(fā)揮重要作用，葡萄糖的代謝取決于細胞對葡萄糖的攝取，其表達水平直接影響機體對葡萄糖的利用，也被稱為胰島素反應性蛋白〔17〕。進一步研究抑制胰島素抵抗的分子調(diào)控機制發(fā)現(xiàn)，脂肪變肝細胞L02細胞中IRS1基因表達升高，p-PI3K、Akt表達水平升高，TNF-α水平下降。在IRS1/PI3K/Akt信號通路中，IRS1是一種能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，機體內(nèi)的胰島素通過特異性地結(jié)合胰島素受體，激活IRS1等底物進而發(fā)揮調(diào)控血糖的作用。而PI3K/Akt信號通路是經(jīng)典的胰島素信號轉(zhuǎn)導的主要途徑〔18〕,當胰島素與細胞表面胰島素受體結(jié)合后，激活IRS1蛋白酪氨酸的磷酸化，進而使PI3K磷酸化，產(chǎn)生瀑布效應，使得Akt磷酸化被激活，并促使GLUT4轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收。相反，則可能導致胰島素抵抗〔19〕。Zhang等〔20〕研究表明， 一種肝臟保護劑(SIL)能夠通過IRS1/PI3K/Akt 信號通路改善脂肪變肝細胞和胰島素抵抗。也有研究表明，當IRS1/PI3K/Akt信號通路被激活后，能夠?qū)⒏嗟腉LUT4從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜，從而增加細胞對葡萄糖的攝取〔21〕，與本實驗結(jié)果相一致，說明Ang(1～7)還可以通過PI3K/Akt/TNF-α信號途徑降低肝細胞凋亡，改善NASH。

綜上，Ang(1～7)可以通過IRS1/PI3K/Akt信號通路提高細胞膜GLUT4含量，同時減少TNF-α的表達，減少肝細胞中膽固醇、ALT含量，改善胰島素抵抗，從而達到減輕NASH的作用。