文 鐸，劉琬琳，曹一鳴，渠 寧，朱永學(xué)

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的人類內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，目前已成為女性第5大常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中又以甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最為常見(jiàn)，并且近年來(lái)，其發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)［1］。盡管PTC的臨床生物學(xué)行為相對(duì)惰性，經(jīng)過(guò)合理的治療后10年生存率可達(dá)90%以上，但是由于其解剖位置與氣管、食管、喉返神經(jīng)、甲狀旁腺等重要器官毗鄰，相當(dāng)一部分晚期或復(fù)發(fā)的患者由于腫瘤的局部侵犯，既無(wú)法獲得良好的手術(shù)根治效果，又不得不面對(duì)嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥和器官功能喪失［2］。因此早期診斷和高危人群的篩選一直以來(lái)都是PTC防治的關(guān)鍵，而對(duì)PTC發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)則是協(xié)助臨床醫(yī)師進(jìn)行人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷的基礎(chǔ)。

相關(guān)資料顯示，在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期和晚期階段，腫瘤細(xì)胞在穿越原發(fā)及繼發(fā)臟器的基底膜進(jìn)入腫瘤周圍的實(shí)質(zhì)組織時(shí)形成一種不對(duì)稱的膜性突起結(jié)構(gòu)——侵襲性偽足，以降解和重塑腫瘤周圍的細(xì)胞外基質(zhì)［3］。有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，非受體酪氨酸激酶Abl通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-Src-Arg-cortactin

信號(hào)通路，調(diào)節(jié)cortactin的磷酸化和聚合，促進(jìn)侵襲性偽足成熟及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力［4］。另一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用N-WASP敲除細(xì)胞及異種移植模型，發(fā)現(xiàn)敲除N-WASP分子能明顯減少體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足的形成，同時(shí)顯著抑制敲除細(xì)胞移植模型中細(xì)胞突觸的形成、穿膜和肺轉(zhuǎn)移能力［5］。但目前在PTC中侵襲性偽足的關(guān)鍵蛋白cortactin和N-WASP的相關(guān)性研究相對(duì)較少。因此，本研究探討PTC組織中cortactin、N-WASP的表達(dá)水平及意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

將2015年1月—2017年12月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科接診的89例PTC患者納入本研究，其中男性21例，女性68例，年齡33～75歲，平均年齡（51.34±8.77）歲。根據(jù)患者臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期44例。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料不完整。

1.2 方法

1.2.1 研究方法

選擇89例PTC標(biāo)本的石蠟包埋組織塊，分別切取癌組織和癌旁組織，進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色確診。同時(shí)對(duì)89例PTC患者的病理學(xué)特征進(jìn)行分析。

1.2.2 試劑來(lái)源

鼠抗人單克隆抗體Cortactin、鼠抗人單克隆抗體N-WASP試劑盒及DAB試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)cortactin、N-WASP的表達(dá)情況，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。已知陽(yáng)性反應(yīng)片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)

石蠟包埋組織切片3～4 μm厚度?？酒簩⒋銮衅糜谇衅苌希?0 ℃恒溫烤箱中至少烤1 h；脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；水化：切片經(jīng)無(wú)水乙醇5 min，95%乙醇2次（每次2 min），85%乙醇2 min，75%乙醇2 min，自來(lái)水沖洗，ddH2O洗2×2 min；抗原修復(fù)：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫度達(dá)到98～100 ℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來(lái)水沖洗，ddH2O洗2× 2 min，TBS洗滌2×2 min；封閉：滴加試劑B， 37 ℃濕盒溫育30 min；加一抗：滴加即用型一抗，4 ℃濕盒溫育過(guò)夜 ；洗滌：TBS-T洗滌3×5 min；封閉：滴加試劑B，37 ℃濕盒溫育10 min；加二抗：滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗，37 ℃濕盒中溫育30 min；洗滌：TBS-T洗滌3×5 min；滴加試劑Tween20， 37 ℃濕盒溫育封閉20 min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（horseradish peroxidase-streptavidin，HRP-SA）：滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1∶50～1∶200，終濃度5～20 nmol/L），37 ℃濕盒中溫育30 min；洗滌：TBS-T洗滌3×5 min，TBS洗滌2×5 min；顯色：應(yīng)用DAB溶液顯色；復(fù)染：自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；封片：待組織標(biāo)本風(fēng)干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片。采用試劑盒提供的陽(yáng)性、陰性對(duì)照樣本進(jìn)行質(zhì)控［6］。

1.3 結(jié)果判斷

Cortactin、N-WASP均以細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)淺黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和著色細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：

① 染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；② 著色細(xì)胞比例：無(wú)著色細(xì)胞為0分，著色細(xì)胞比例＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。將染色強(qiáng)度和著色細(xì)胞比例得分相乘，最終得分≤3分為陰性，＞3分為陽(yáng)性［6］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTC組織和癌旁組織中cortactin、N-WASP的表達(dá)

PTC組織中cortactin和N-WASP的陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.30%和59.55%，顯著高于癌旁組織的5.62%和7.87%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1，表1）。

圖 1 PTC組織與癌旁組織中cortactin和N-WASP蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖Fig. 1 Schematic diagram of cortactin and N-WASP protein expressions in PTC and adjacent tissues

表 1 PTC組織和癌旁組織中cortactin、N-WASP的表達(dá)Tab. 1 Expression levels of cortactin and N-WASP in PTC and adjacent tissues

2.2 Cortactin、N-WASP的表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

PTC中cortactin、N-WASP的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性見(jiàn)表2～3。Cortactin的表達(dá)和年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），但是與有無(wú)無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），N-WASP與腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，cortactin和N-WASP的陽(yáng)性表達(dá)率均較高（P＜0.05）。

表 2 Cortactin的表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab. 2 The relationship between cortactin expression and clinicopathological features of PTC

表 3 N-WASP的表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab. 3 The relationship between N-WASP expression and clinicopathological features of PTC

2.3 PTC組織中cortactin、N-WASP相關(guān)性

Cortactin及N-WASP的共同表達(dá)率達(dá)47.19%，采用Spear man分析結(jié)果顯示，兩者顯著相關(guān) （P＜0.05，表4）。

表 4 PTC組織中cortactin與N-WASP的表達(dá)相關(guān)性Tab. 4 The correlation between cortactin and N-WASP expression in PTC tissues

3 討 論

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶播散至繼發(fā)臟器并最終形成臨床可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移灶是一個(gè)多基因參與、連續(xù)多環(huán)節(jié)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑、新生腫瘤血管的發(fā)生以及機(jī)體免疫微環(huán)境的形成等諸多環(huán)節(jié)［7-9］。在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期和晚期階段，腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)及繼發(fā)臟器的基底膜、進(jìn)入腫瘤周圍的實(shí)質(zhì)組織時(shí)常形成一種不對(duì)稱的膜性突起結(jié)構(gòu)——侵襲性偽足，以降解和重塑腫瘤周圍的細(xì)胞外基質(zhì)［10］。

侵襲性偽足是腫瘤細(xì)胞形成的一種特殊的以cortactin為核心蛋白的富含肌動(dòng)蛋白的膜突起性結(jié)構(gòu)，主要介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［4］。侵襲性偽足的膜性結(jié)構(gòu)主要由流動(dòng)性的脂質(zhì)分子及其錨著的蛋白分子組成，具體有脂筏、肌動(dòng)蛋白、Src受體酪氨酸蛋白（Src酪氨酸激酶蛋白家族）、黏附分子及蛋白水解酶等，可傳導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并分泌具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶［4，11］。許多蛋白質(zhì)涉及調(diào)節(jié)侵襲性偽足的形成，包括Rho家族GTPases Rac和Cdc42，P21激活的激酶的成員，細(xì)胞-基質(zhì)黏附相關(guān)的蛋白質(zhì)（Paxillin蛋白和N-WASP蛋白）［12］。近年來(lái)，研究人員已經(jīng)在來(lái)自許多不同組織類型（包括肝臟、乳腺、膀胱等）的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了侵襲性偽足形成的證據(jù)。有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，cortactin分子中的N端和C端結(jié)構(gòu)域能與Arp2/3復(fù)合體和N-WASP的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使cortactin蛋白分子中的Tyr421、466、482殘基發(fā)生磷酸化，通過(guò)Nck1-N-WASPArp2/3信號(hào)通路調(diào)節(jié)侵襲性偽足的形成［13-14］。Genna等［15］研究發(fā)現(xiàn)，非受體酪氨酸激酶Pyk2可以通過(guò)EGFR-Pyk2-Src-Arg-cortactin信號(hào)通路，介導(dǎo)Abl相關(guān)基因（Arg）激活，直接或間接介導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的cortactin的酪氨酸磷酸化和聚合，導(dǎo)致侵襲性偽足肌動(dòng)蛋白聚合，促進(jìn)侵襲性偽足成熟，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。WASP家族蛋白分子是細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)分子Cdc42和Rho的感受器，其主要定位于脂筏，能通過(guò)活化Arp2/3引起actin分子在細(xì)胞內(nèi)重排，促進(jìn)侵襲性偽足的快速形成和成熟［16］。此外，有實(shí)驗(yàn)表明，敲除N-WASP后能明顯減少體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足的形成，同時(shí)顯著抑制敲除細(xì)胞移植模型中細(xì)胞突觸的穿膜能力［5］。有研究團(tuán)隊(duì)利用actin與cortactin分子標(biāo)記進(jìn)一步證實(shí)侵襲性偽足主要存在于富血管區(qū)鄰近的腫瘤邊緣，并常伴有腫瘤局部組織膠原蛋白的降 解［14］。提示侵襲性偽足對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控至關(guān)重要。本研究將cortactin和N-WASP抗體聯(lián)合應(yīng)用于PTC組織的檢測(cè)，觀察兩種指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的可能性。結(jié)果顯示，癌組織中cortactin及N-WA S P 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為5 7.3 0%和59.55%，高于癌旁組織的5.62%和7.87%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Cortactin的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況明顯相關(guān)（P＜0.05），N-WASP與腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。而且兩者的共同表達(dá)率達(dá)47.19%，說(shuō)明兩者都在乳頭狀癌的腫瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮作用，而且可能還有協(xié)同作用，應(yīng)用于聯(lián)合檢測(cè)有一定的潛在可能。但是，因?yàn)楸狙芯渴腔仡櫺匝芯浚覂H對(duì)石蠟包埋組織標(biāo)本的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，所以在更深入分子水平的研究及前瞻性研究還有待下一步進(jìn)行。

綜上所述，PTC組織中侵襲性偽足關(guān)鍵蛋白cortactin、N-WASP的陽(yáng)性表達(dá)率高，與癌旁組織有明顯差異。Cortactin、N-WASP之間可能存在協(xié)同作用，與患者臨床病理特征有一定關(guān)系，也與PTC的生物學(xué)行為密切相關(guān)。