耿文文，蒲 倩，高海東

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院（青島）普外科，山東 青島 266000

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，主要包括：瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤解離，穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)，侵入血管，在血循環(huán)中生存，侵出血管，并在遠(yuǎn)隔部位增殖形成微灶，繼續(xù)生長(zhǎng)最終形成臨床可見的轉(zhuǎn)移灶，瘤細(xì)胞必須完成所有這些過(guò)程才能形成轉(zhuǎn)移瘤［1］。在整個(gè)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞首先需要獲得侵襲和移動(dòng)能力才有可能啟動(dòng)轉(zhuǎn)移，因此這一步驟被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的限速步驟，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）過(guò)程又是其中的關(guān)鍵步驟［2］，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有重要意義，阻止惡性上皮細(xì)胞的EMT過(guò)程則有可能成為阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的新思路。Runx2是多瘤病毒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白2/核心結(jié)合因子（polyomavirus enhancer binding protein 2/core binding factor，PEBP2/CBF）轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)［3］。研究表明，Runx2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路中重要的組成部分，而TGF-β通路在腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中具有重要的作用［4-5］，所以本研究著重探討TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程以及Runx2在其中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞系

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，傳代培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的條件下貼壁生長(zhǎng)。RPMI-1640及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；TGF-β1購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；纖維連接蛋白（fibronectin）抗體、Runx2抗體、E-cadherin抗體和波形蛋白（vimentin）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，p-Smad2/3抗體、p-AKT抗體（Cell Signaling USA）和p-ERK1/2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，β-actin單克隆抗體（鼠抗人）、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，LY294002［磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide3-kinases/protein kinase B，PI3K/AKT）通路抑制劑］、PD98059［絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）通路抑制劑］和Runx2-siRNA購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。

1.2 TGF-β1誘導(dǎo)EMT實(shí)驗(yàn)［6］

EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的細(xì)胞的過(guò)程。該過(guò)程包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變及基因型的改變，具體包括：① 細(xì)胞黏附分子如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少，導(dǎo)致立方上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間相互作用，細(xì)胞極性喪失；② 立方上皮細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白結(jié)構(gòu)改變，外形演變?yōu)榧忓N形纖維細(xì)胞形態(tài)；③ 獲得了纖維原細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞的“特性”，包括vimentin及其他間質(zhì)蛋白如fibronectin表達(dá)的上調(diào)，細(xì)胞獲得較強(qiáng)的侵襲和移動(dòng)能力。

將A549細(xì)胞消化離心后制成細(xì)胞懸液，向6孔板中接種，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。使細(xì)胞生長(zhǎng)均勻，直至貼壁。待顯微鏡下觀察細(xì)胞已長(zhǎng)至6孔板底壁的80%左右，向瓶中加入約2 mL RPMI-1640培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞12 h過(guò)夜后加入TGF-β1母液，將濃度調(diào)整為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 ng/mL。將6孔板置于 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)，設(shè)不同的時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、48、72和96 h）觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染

以不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基 5 0 0 μ L 分別稀釋兩種s i R N A 母液及非特異性siRNA母液至終濃度為10 nmol/L，此為A液，室溫放置5 min；以不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL分別稀釋10 μL的LipofectamineTM2000三管，此為B液，室溫放置5 min。分別輕柔混合AB液，室溫放置20 min，將混勻后的AB液分別均勻地滴入含4 mL RPMI-1640培養(yǎng)基（不含血清和抗生素）的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。轉(zhuǎn)染后6 h更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h的細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）鑒定Runx2蛋白的抑制效果，篩選最佳的干擾序列、作用時(shí)間和干擾濃度。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白水平

消化收集各組的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白后應(yīng)用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白含量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，于冰上濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜后置于含5%牛血清白蛋白的洗膜緩沖液（TRIS-buffered saline Tween，TBST）中封閉2 h，加入一抗，4 ℃溫育過(guò)夜，TBST振蕩洗膜10 min×3次，以封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫溫育1 h，TBST洗膜10 min×3次。于暗室中加入ECL顯色液曝光，采用Image J進(jìn)行灰度分析

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所獲數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用ANOVA單因素方差分析，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β1可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT

首先根據(jù)相關(guān)研究［6］確定了TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549發(fā)生EMT形態(tài)變化的最佳濃度和時(shí)間，分別利用不同濃度（0.0、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 ng/mL）TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、48、72和96 h）利用相差光學(xué)顯微鏡評(píng)估TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，5 ng/mL TGF-β1在48 h可以使A549細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，72 h之后更加顯著。A549細(xì)胞培養(yǎng)在空白對(duì)照組呈現(xiàn)經(jīng)典的鵝卵石上皮形態(tài)和生長(zhǎng)模式，但是經(jīng)過(guò)5 ng/mL TGF-β1處理后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，極性喪失，細(xì)胞變得離散，呈現(xiàn)更多的纖維母細(xì)胞形態(tài)并減少了細(xì)胞間的連接（圖1）。同時(shí)，在TGF-β1 5 ng/mL誘導(dǎo)細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白水平下降（P＜0.05），而間質(zhì)蛋白vimentin、fibronectin表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），證明在此過(guò)程中TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生了EMT。與對(duì)照組相比，Runx2的表達(dá)也發(fā)生上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.2 干擾Runx2表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT

設(shè)立空白對(duì)照組、TGF-β1組及siRunx2干擾組，后兩組分別利用5 ng/mL TGF-β1處理細(xì)胞，48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，極性喪失，細(xì)胞變得離散（圖3）；而經(jīng)過(guò)Runx2-siRNA處理下調(diào)Runx2表達(dá)的細(xì)胞，加入TGF-β1刺激細(xì)胞之后，與對(duì)照組相比細(xì)胞并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化。TGF-β1刺激細(xì)胞48 h后細(xì)胞的間質(zhì)蛋白vimentin、fibronectin表達(dá)上調(diào)，而上皮蛋白E-cadherin表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；而經(jīng)過(guò)Runx2-siRNA處理下調(diào)Runx2的表達(dá)的細(xì)胞，加入TGF-β1刺激，EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cadherin、vimentin、fibronectin表達(dá)未發(fā)生明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05，圖4）。由此可見，干擾Runx2表達(dá)抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖 1 TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中A549細(xì)胞形態(tài)變化Fig. 1 Morphological changes of A549 cells induced by TGF-β1 in the EMT process

圖 2 5 ng/mL 的TGF-β1作用于細(xì)胞48 h后，EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白及Runx2蛋白的表達(dá)變化Fig. 2 Comparison of EMT-related marker expression and Runx2 in response to 5 ng/mL TGF-β1 after 48 h

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中，激活了Smad2通路及旁路PI3K/AKT和MAPK/ERK通路

設(shè)立空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組利用5 ng/mL TGF-β1處理細(xì)胞1、3和6 h，通過(guò)Western blot檢測(cè)TGF-β通路相關(guān)蛋白磷酸化水平變化研究通路活化情況。與對(duì)照組相比，TGF-β1刺激細(xì)胞后，Smad2蛋白磷酸化增強(qiáng)（P＜0.05），Smad2通路被激活；同時(shí)旁路蛋白AKT和ERK磷酸化增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。結(jié)果說(shuō)明，TGF-β1刺激A549細(xì)胞后，除了經(jīng)典的Smad2通路，PI3K/AKT和MAPK/ERK通路也被激活。

圖 3 干擾Runx2表達(dá)阻止TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT形態(tài)變化Fig. 3 Interference with Runx2 expression prevented EMT morphological changes of A549 cells induced by TGF-β1

圖 4 干擾Runx2表達(dá)對(duì)于A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白水平的影響Fig. 4 Effect of Runx2 siRNA on EMT-related protein expression induced by TGF-β1 in A549 cells

圖 5 5 ng/mL of TGF-β1作用A549細(xì)胞1 h后激活Smad2通路、PI3K/AKT和MAPK/ERK通路Fig. 5 Smad2 pathway and the PI3K/AKT and MAPK/ERK pathways were activated in TGF-β1 induced EMT process within 1 h in A549 cells

2.4 TGF-β1主要通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)Runx2表達(dá)影響A549細(xì)胞發(fā)生EMT

分別利用特異性通路阻斷劑LY294002（PI3K/AKT通路抑制劑）、PD98059（MAPK/ERK通路抑制劑）阻斷TGF-β旁路。結(jié)果顯示，PI3K/AKT通路被阻斷后，Runx2表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤細(xì)胞未發(fā)生EMT形態(tài)變化；而MAPK/ERK通路阻斷后，Runx2表達(dá)未發(fā)生明顯變化（P＞0.05），而腫瘤細(xì)胞依然發(fā)生EMT形態(tài)變化（圖6）。說(shuō)明Runx2在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT過(guò)程中，主要是受到PI3K/AKT的調(diào)節(jié)。

圖 6 阻斷PI3K/AKT（A）和MAPK/ERK通路（B）對(duì)Runx2表達(dá)及A549細(xì)胞EMT形態(tài)變化的影響Fig. 6 Effects of blocking PI3K/AKT (A) and MAPK/ERK (B) pathways on the expression of Runx2 and EMT process in A549 cells

3 討 論

TGF-β可以自分泌和旁分泌的形式作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。目前，絕大多數(shù)關(guān)于EMT的研究都是基于TGF-β誘導(dǎo)模型［7］。Smads家族蛋白在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8-9］。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物，激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制其調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smads是很多EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，與多種活化/抑制因子組成“共調(diào)節(jié)復(fù)合體”調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［10-11］，PEBP2/CBF家族蛋白即為其中重要一員。其中與腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)性最大的是Runx2［12］。Runx2介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)于TGF-β1/BMP等生長(zhǎng)因子的反應(yīng)性，沉默Runx2表達(dá)則會(huì)降低細(xì)胞對(duì)TGF-β的反應(yīng)性［13］。雖然TGF-β家族激活的特異性R-Smad（Smad2/3、Smad1/5/8）能與許多轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，但Runx家族蛋白是TGF-β超家族的特異性靶點(diǎn)之一，與TGF-β超家族信號(hào)通路的聯(lián)系更為直接［14］。除此之外，Runx2的轉(zhuǎn)錄活性還受到其他細(xì)胞外信號(hào)通路的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活的ERK-MAPK通過(guò)磷酸化Runx2蛋白增強(qiáng)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞內(nèi)的Runx2蛋白增多，從而進(jìn)一步增強(qiáng)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性［15］。

本實(shí)驗(yàn)利用TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞，使用5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)72 h之后，A549細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞形態(tài)變成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞變得離散，細(xì)胞間黏附消失。同時(shí)細(xì)胞上皮蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)蛋白vimentin、fibronectin表達(dá)明顯上升，證明細(xì)胞發(fā)生了EMT過(guò)程，同時(shí)與TGF-β通路密切相關(guān)的蛋白R(shí)unx2表達(dá)也發(fā)生上調(diào)。所以，在已經(jīng)構(gòu)建了穩(wěn)定的細(xì)胞EMT模型基礎(chǔ)上，我們繼續(xù)研究Runx2在腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中的關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Runx2-siRNA干擾沉默Runx2之后的細(xì)胞接受TGF-β1刺激之后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間質(zhì)指標(biāo)都未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明沉默Runx2表達(dá)可以阻止細(xì)胞發(fā)生EMT，Runx2在細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步探討了Runx2在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞接受TGF-β1刺激之后，TGF-β-Smad通路及旁路PI3K/AKT和MAPK/ERK通路都受到激活。利用特異性通路抑制劑抑制旁路PI3K/AKT通路之后，Runx2表達(dá)受到下調(diào)，而且同時(shí)腫瘤細(xì)胞也未發(fā)生EMT形態(tài)變化。而阻斷MAPK/ERK通路后，Runx2表達(dá)并未受到影響，而且腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程也未受到阻斷，表明在TGF-β旁路中，主要是通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)控Runx2表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程。但是，Runx2在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，Runx2在TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，干擾Runx2的表達(dá)可以阻止細(xì)胞發(fā)生EMT，因此，Runx2有可能作為腫瘤治療靶點(diǎn)用于抑制腫瘤早期轉(zhuǎn)移。