鐘淑賢　石雨晴　楊亞蘭　申倩　胡佩欣　李春

[摘要]目的：觀察龜板有效成分對(duì)脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)及周期的影響。方法：制作小鼠休止期脫毛模型。脫毛后分組，其中陽性對(duì)照組予5%米諾地爾溶液、實(shí)驗(yàn)A、B、C組分別予0.15%、0.2%、0.4%龜板有效成分溶液外用于脫毛區(qū)。比較各組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)差異，且在實(shí)驗(yàn)第19天切取小鼠背部脫毛區(qū)皮膚作HE染色及毛囊計(jì)數(shù)，觀察龜板有效成分對(duì)毛囊數(shù)量的影響。結(jié)果：適當(dāng)濃度的實(shí)驗(yàn)B組與陽性對(duì)照組的小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)優(yōu)先于其他組;實(shí)驗(yàn)組小鼠毛囊毛干色素深，以終毛為主;實(shí)驗(yàn)組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚毛囊數(shù)量比模型組多（P<0.05），有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：龜板有效成分能促進(jìn)毛發(fā)和毛囊生長(zhǎng)，延長(zhǎng)毛發(fā)生長(zhǎng)期。

[關(guān)鍵詞]龜板有效成分;休止期脫發(fā);毛發(fā)生長(zhǎng);毛發(fā)周期;毛囊

[中圖分類號(hào)]R329.2+8? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）10-0096-03

Abstract： Objective? To observe the effects of the effective components of tortoise shell on hair growth and cycle of hair loss model mice. Methods? The model of hair loss of telogen in mice was made. After depilation， positive control group were given 5% minoxidil solution and experimental group A， B， C were given 0.15%， 0.2%， 0.4% tortoise shell effective components solution respectively for the hair removal area. Comparison of hair growth differences between groups. The skin of the back hair of the mice was excised for HE staining and hair follicle count on the 19th day of the experiment， and the effect of the effective components of tortoise shell on the number of hair follicles was observed. Results? Appropriate concentration of experimental group B and positive control mice hair growth prior to other groups. The hair shaft colour of hair follicle of experimental mice were deep， which mainly were terminal hair. The number of hair follicles in the back depilation area of the experimental group was higher than that of the model group （P<0.05）， which was statistically significant. Conclusion? The effective components of tortoise shell promote the growth of hair and hair follicles and prolong the hair anagen.

Key words： effective components of tortoise shell; hair loss of telogen; hair growth; hair growth cycle; hair follicles

龜板味甘、咸、性寒，歸肝、腎、心經(jīng)，《本草綱目》記載“龜甲以補(bǔ)腎添精、補(bǔ)血滋陰為用”，具有補(bǔ)腎填精、滋陰潛陽、益腎健骨之功效。十四酸甾醇酯（Cholesterol Myristate， S8）和甾酮（（+）-Cholesten-3-one， S9）是龜板乙酸乙酯提取物中最具生物活性的單體[1]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，龜板有效成分在促進(jìn)大鼠傷口愈合的同時(shí)，促進(jìn)了毛發(fā)的生長(zhǎng)?；谀I“其華在發(fā)”理論，通過對(duì)腎臟的調(diào)理，本文探討龜板有效成分對(duì)毛發(fā)的作用，旨在進(jìn)一步深入研究龜板的功效。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5～6周齡雄性C57BL/6J小鼠（SPF級(jí)），廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0034。

1.2 主要試劑：米諾地爾購于上海易勢(shì)化工有限公司，貨號(hào)：RC503218;（+）-4-Cholesten-3-one（S9）購于Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.貨號(hào)：C1366。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脫發(fā)模型建立：小鼠分籠飼養(yǎng)1周后，將松香和石蠟按1：1比例加熱混合融化后，均勻涂抹于小鼠背部，面積為2cm×2cm，冷卻凝固后揭去，以去除背毛。小鼠的皮膚在毛發(fā)生長(zhǎng)期呈黑色，退行期呈灰色，休止期呈粉紅色[2]。揭毛后確認(rèn)毛發(fā)處于生長(zhǎng)周期中的休止期，皮膚顏色為粉紅色。

1.3.2 動(dòng)物分組及干預(yù)：脫毛后，選取脫毛區(qū)皮膚光滑無皮損的小鼠，隨機(jī)分為模型組6只、陽性對(duì)照組6只、實(shí)驗(yàn)A組6只，實(shí)驗(yàn)B組6只，實(shí)驗(yàn)C組6只。干預(yù)措施分別為：①模型組：造模不給藥;②陽性對(duì)照組：造模后，給予5%米諾地爾外用，每天早上1次;③實(shí)驗(yàn)A組：造模后，給予0.15%龜板有效成分溶液外用;④實(shí)驗(yàn)B組：造模后，給予0.2%龜板有效成分溶液外用;⑤實(shí)驗(yàn)C組：造模后，給予0.4%龜板有效成分溶液外用，實(shí)驗(yàn)組給藥早晚1次。連續(xù)給藥19d。

1.3.3 觀察記錄結(jié)果：每天觀察小鼠脫毛區(qū)皮膚顏色和毛發(fā)生長(zhǎng)情況，并定期拍照。第19天，取各組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚組織塊，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察，每張片在高倍鏡下選取3個(gè)視野進(jìn)行毛囊計(jì)數(shù)，每個(gè)視野盡量不重疊。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Stata/MP 13.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較的Bonferroni法分析數(shù)據(jù)，均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料。

2? 結(jié)果

2.1 不同濃度的龜板有效成分對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的影響：小鼠均在脫毛后第5～6天局部皮膚逐漸變黑，毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期。第9天時(shí)，實(shí)驗(yàn)B組與陽性對(duì)照組已長(zhǎng)出毛發(fā)。此外，第10天時(shí)，低、高濃度的實(shí)驗(yàn)A、C組的毛發(fā)生長(zhǎng)速度明顯落后于適當(dāng)濃度的實(shí)驗(yàn)B組，甚至落后于毛發(fā)自然生長(zhǎng)的模型組。各組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)情況見圖1。

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 實(shí)驗(yàn)第19天，切取每組小鼠背部皮膚，石蠟切片，HE染色進(jìn)行觀察：陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組視野范圍內(nèi)毛囊數(shù)量明顯比模型組多。實(shí)驗(yàn)組毛干色素深，以終毛為主，模型組與陽性對(duì)照組毛干色素淺甚至無，以毳毛為主。各組小鼠背部皮膚HE染色（400×）見圖2。

2.2.2 龜板有效成分對(duì)毛囊數(shù)量的影響：實(shí)驗(yàn)第19天，各組小鼠毛囊數(shù)量見表1。按α=0.01水準(zhǔn)，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=5.61，P=0.0023，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故模型組、陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組涂抹的藥物對(duì)毛囊數(shù)量的影響不完全相同。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，模型組與實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組、實(shí)驗(yàn)C組比較，P=0.015、P=0.005、P=0.011，均P<0.05，故模型組與實(shí)驗(yàn)組具有顯著性差異，尤以實(shí)驗(yàn)B組差異最大。

3? 討論

龜板是一味補(bǔ)腎健骨的傳統(tǒng)中藥，具有促進(jìn)成骨分化、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等功能。研究表明，龜板提取物可能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化[3];促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化[4];對(duì)多發(fā)性抽動(dòng)癥有良好的治療作用[5];防治糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨量丟失、骨質(zhì)量的損害及骨生物力學(xué)的減弱、骨形態(tài)的破壞和小梁骨表面破骨[6];還可能通過調(diào)控毛囊干細(xì)胞促進(jìn)SD大鼠壓瘡創(chuàng)面修復(fù)[7]。目前國(guó)內(nèi)外可見龜板對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖影響的研究，未見龜板對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)影響的相關(guān)報(bào)道。在正常的生理情況下，毛囊干細(xì)胞參與毛囊與毛發(fā)的再生。本研究以C57BL/6J小鼠為模型，設(shè)立模型組、陽性對(duì)照組和不同濃度的實(shí)驗(yàn)組，觀察外用龜板提取物溶液對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)、毛囊數(shù)量等影響。

米諾地爾溶液是臨床應(yīng)用極為廣泛的一種治療各類脫發(fā)的藥物，它能夠延長(zhǎng)毛發(fā)生長(zhǎng)期，縮短休止期，提高生長(zhǎng)期/退行期的比例，舒張血管，增加局部血供，為毛囊提供更多的養(yǎng)分，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[8]。根據(jù)診療指南[9-10]，推薦男性患者使用5%米諾地爾，故本研究選用5%米諾地爾溶液為陽性對(duì)照。

本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)B組與陽性對(duì)照組優(yōu)先長(zhǎng)出了毛發(fā)，低、高濃度的實(shí)驗(yàn)A、C組的毛發(fā)生長(zhǎng)速度落后于適當(dāng)濃度的實(shí)驗(yàn)B組，表明適當(dāng)濃度的龜板有效成分可能與米諾地爾一樣具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用。小鼠毛發(fā)呈黑色，皮膚中的黑素細(xì)胞均分布于毛囊，僅在毛發(fā)生長(zhǎng)期才合成分泌黑素，并將黑素傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞，使皮膚呈黑色，因此觀察小鼠毛囊數(shù)量以及色素深淺是判斷小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)狀況的重要依據(jù)。從第19天小鼠背部皮膚HE染色和毛囊計(jì)數(shù)可觀察到實(shí)驗(yàn)組毛囊數(shù)量普遍比模型組多，毛干色素深，以終毛為主，表明龜板有效成分能促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)，使毛發(fā)持續(xù)處于生長(zhǎng)期，延長(zhǎng)毛發(fā)生長(zhǎng)期。

本研究結(jié)果顯示龜板有效成分能促進(jìn)毛發(fā)和毛囊生長(zhǎng)，延長(zhǎng)毛發(fā)生長(zhǎng)期，但由于人與動(dòng)物有著種屬差異，龜板有效成分是否具有促進(jìn)人毛發(fā)生長(zhǎng)作用還未知，此外其促毛發(fā)生長(zhǎng)的機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]田瑞敏.龜板有效成分調(diào)控毛囊干細(xì)胞Wnt/BMP信號(hào)及其對(duì)壓瘡的影響[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[2]李云飛，林佩，賀嫣然，等.天然藥物對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)影響因素調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2014，45（11）：1655-1662.

[3]周笑莉，劉憶思，陳東風(fēng)，等.龜板提取物調(diào)控Otx2基因促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（2）：171-176.

[4]沈耿楊.龜板有效成分調(diào)節(jié)let-7f靶向TNFR2促BMSCs成骨分化的機(jī)制研究[C].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科學(xué)術(shù)年會(huì)，2017：2.

[5]方錦穎，陳琪，國(guó)文文，等.龜板對(duì)多發(fā)性抽動(dòng)癥模型大鼠的干預(yù)作用與對(duì)DA及D2受體的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2016，9（7）：781-784.

[6]任輝.龜板防治GIOP中miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin通路的機(jī)理研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[7]李春，田瑞敏，李瑜，等.龜板提取物調(diào)控毛囊干細(xì)胞Wnt/BMP信號(hào)通路促進(jìn)大鼠壓瘡修復(fù)[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，36（1）：87-93.

[8]王璇，王瑾.雄激素源性脫發(fā)的機(jī)制及藥物治療進(jìn)展[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2018，5（33）：186-188.

[9]張建中.中國(guó)雄激素性禿發(fā)診療指南[J].臨床皮膚科雜志，2014，43（3）：182-186.

[10]Motomu MANABE，Ryoji TSUBOI，Satoshi ITAMI，et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of male-pattern and female-pattern hair loss，2017 version[J].J Dermatol，2018，45（9）：1-13.

[收稿日期]2019-03-25

本文引用格式：鐘淑賢，石雨晴，楊亞蘭，等.龜板有效成分對(duì)小鼠毛囊生長(zhǎng)和毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（10）：96-98.