李鐵純,侯冬巖,回瑞華,刁全平

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 鞍山 114007)

DHA和EPA主要來源于魚類、海藻類及菌類，是人體自身不能合成的必需脂肪酸，它們具有不同的生理活性[1，2].DHA對緩解眼疲勞、恢復(fù)視力有很大作用，EPA可抑制血小板聚集，預(yù)防形成血栓，使血液黏度下降，改善血液循環(huán)，降低血壓，可治療高脂血癥、動脈粥樣硬化等[3-6].近年來，隨著人們健康意識的增強，國內(nèi)外對DHA和EPA的研究報道較多.在國外，以富含DHA和EPA的保健品很多，我國這方面起步較晚，但是發(fā)展很快.目前，關(guān)于鯽魚肉中DHA和EPA的分析少見報道.本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定鯽魚肉中DHA和EPA，并測定其相對百分含量[7-9]，采用高效液相色譜法定量分析鯽魚肉中DHA和EPA的含量，為從鯽魚肉中提取DHA和EPA提供分析方法.

1 儀器與藥材

1.1 實驗儀器

美國Hewlett Packard公司生產(chǎn)的6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；美國Waters公司生產(chǎn)的1525-2996-tcm 液相色譜儀；上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)的RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等.

1.2 實驗藥材

石油醚(60～90 ℃)、正己烷、甲醇、氯仿、氫氧化鉀(所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水)

樣品：購于鞍山水產(chǎn)市場，鯽魚5尾，每尾均150 g左右.

EPA和DHA標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.99%，美國貝斯藥物技術(shù)有限公司.

1.3 樣品前處理

將新鮮的鯽魚用清水洗凈后去皮取肉，將其肉剪碎.

2 GC-MS法分析鯽魚肉中DHA和EPA

2.1 鯽魚肉中脂肪油的提取

準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)1.3處理過的鯽魚肉放入錐形瓶中，分別加入適量甲醇-氯仿(2∶1.5,體積比)溶液和蒸餾水，攪拌24 h后加入適量氯仿和蒸餾水，再攪拌30 min，經(jīng)過濾，取有機相得到黃色透明油狀提取液.鯽魚肉脂肪油提取率為12.0%.

2.2 甲酯化處理

取適量2.1提取的脂肪油加入適量正己烷和0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，回流20 min，冷卻至室溫，超聲提取并離心.取上清液，待做GC-MS分析.

2.3 色譜分析

彈性石英毛細(xì)管柱：HP-5(30 m×0.25 mm×0.33 μm)；柱溫：150 ℃升到200 ℃，升溫速率為10 ℃/min，200 ℃升到250 ℃，升溫速率為5 ℃/min，250 ℃升到280 ℃，升溫速率為10 ℃/min(保持 5 min)；汽化室溫度為300 ℃；分流比：50∶1.

2.4 質(zhì)譜條件

電子轟擊源；離子源溫度220 ℃；接口溫度230 ℃；掃描范圍m/z：20～500.

2.5 測定方法及結(jié)果

取經(jīng)2.2處理過的樣品，進行GC/MS分析.鯽魚肉脂肪酸甲酯組成的總離子流圖如圖1.鯽魚肉脂肪酸甲酯組成及相對百分含量測定結(jié)果如表1.

圖1 鯽魚肉脂肪酸甲酯的總離子流圖

序號保留時間/min化合物相對百分含量/%匹配度/%15.3512-甲基-十三烷酸甲酯1.549527.319-十六碳烯酸甲酯3.729937.5414-甲基-十五烷酸甲酯17.109849.779,12-十八碳二烯酸酯20.979959.8513-十八碳烯酸甲酯27.8599610.25十八烷酸甲酯4.0396712.265,8,11,14,17-二十碳五烯酸甲酯8.1290812.6811-二十碳烯酸甲酯2.8092914.924,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸甲酯5.3390

由表1可知，鯽魚肉中鑒定出4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸，即DHA為5.33%；5,8,11,14,17-二十碳五烯酸，即EPA為8.12%.

3 鯽魚肉中DHA和EPA的HPLC定量分析

3.1 樣品前處理

精確稱取經(jīng)2.1提取的脂肪油0.5 g，加入50 mL NaOH-C2H5OH(2 mol/L)溶液，回流1 h后加入適量水，用正己烷萃取未皂化部分，重復(fù)2次，水層加入鹽酸酸化后用正己烷萃取游離脂肪酸，合并正己烷層并水洗至中性、干燥、除去溶劑，用甲醇稀釋到10 mL備用.

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取DHA標(biāo)準(zhǔn)品0.015 00 g，EPA標(biāo)準(zhǔn)品0.010 50 g，用甲醇溶解定容至25 mL容量瓶中，配成含DHA 0.60 mg/mL和 EPA 0.42 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液并過濾，濾液備用.

3.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10.0 μL.

3.4 檢測波長的確定

取標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，當(dāng)檢測波長為211 nm時，基線平穩(wěn)、DHA和EPA完全分離且峰形對稱，選擇檢測波長為211 nm，其HPLC色譜圖如圖2.

圖2 DHA和EPA標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC色譜圖

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取3.2配制的DHA標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1，0.9，1.7，2.5，3.3，4.1，4.9 mL和EPA標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2，1.0，1.8，2.6，3.4，4.2，5.0 mL于容量瓶中，加入甲醇定容到10 mL.在3.3條件下測定，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與色譜峰面積之間的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2.

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

3.6 樣品的測定

取經(jīng)3.1處理的樣品溶液，每個樣品進樣3次，將測得的峰面積代入回歸方程，計算各樣品中DHA和EPA含量為：鯽魚肉含DHA18.56 μg/g；含EPA89.76 μg/g.

3.7 精密度實驗

取適量的DHA和EPA標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過纖維膜過濾，進行HPLC測定，進行精密度實驗，DHA的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%，EPA的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%.

3.8 回收率實驗

精確移取3份相同濃度的樣品溶液，分別加入不同體積的DHA和EPA標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行HPLC測定，DHA的回收率為97.16%～104.2%，EPA的回收率為94.71%～101.1%.

3.9 最低檢出限的測定

取適量DHA和EPA標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，測定出DHA的最低檢出限為4.0 μg/mL，EPA的最低檢出限為5.6 μg/mL.

4 討論

通過提取鯽魚肉中脂肪油并進行甲酯化處理，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定鯽魚肉中的DHA和EPA，測定其相對百分含量DHA為5.33%，EPA為8.12%.采用高效液相色譜法定量分析鯽魚肉中DHA和EPA的含量，鯽魚肉含DHA18.56(μg/g)，含EPA89.76(μg/g).

DHA和腦健康密切相關(guān)，是大腦細(xì)胞膜的重要組成部分.EPA能抑制血小板聚集，降低血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇，增加高密度脂蛋白膽固醇，可治療高脂血癥、動脈粥樣硬化等.不同人對DHA和EPA的攝入是有選擇性的，以健腦益智、恢復(fù)視力為目的需補充DHA，以促進心腦血管循環(huán)為目的需補充EPA.