魯梅芳，黃 浩，劉小艷，陳劉贈，劉新華，李 洪

胃癌(gastric cancer，GC)是一種常見的胃腸道腫瘤，是世界上第四大常見癌癥。超過90%的GC是源自胃黏膜上皮的腺癌。目前，手術仍然是早期疾病的唯一有效的治療方法，但因其早期癥狀不易察覺，所以其早期診斷率較低[1]。晚期GC患者在現(xiàn)有的治療手段下預后不佳。因此確定GC用于早期診斷和靶向治療的生物標志物變得越來越重要[2]。肌腱蛋白C(Tenascin-C， TNC)是一種細胞外糖蛋白，在細胞增殖和遷移及器官發(fā)生等過程中產(chǎn)生[3-4],已被廣泛研究作為不同癌癥的潛在生物標志物。到目前為止TNC在GC中的功能還不清楚。TNC可以與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、整聯(lián)蛋白[5-6]相互作用來調(diào)節(jié)許多細胞內(nèi)信號分子如局部粘著斑激酶、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)的活性，從而在細胞活動中發(fā)揮多種作用[7]。該研究采用免疫組化法檢測TNC在GC組織和細胞系中的表達情況，并進一步探討了TNC在SGC7901細胞生長中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣本本實驗中使用的標本是從解放軍105醫(yī)院手術取出的原發(fā)性GC和活組織檢查中收集的。其中10例胃腺癌病例為男性，8例為女性，年齡39～80(55.5±8.6)歲。患者在手術前均未接受化療，該研究均獲得患者知情同意書，并得到倫理委員會的批準。

1.2 實驗材料及儀器細胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；RPMI-1640 DMEM(美國Hyclone公司)；嘌呤霉素(美國sigma公司)；抗磷酸化AKT、抗AKT Ser 473、抗ERK、抗磷酸化ERK、T202/Y204、抗-ITGB5、8(美國Cell Signaling公司)；TNC、通用型二抗(英國Abcam公司)； pSpcas(BB)-2A-puro載體(北京質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心)；Lipofectamine 2000(美國賽默飛公司)；抗磷酸-JNK、抗JNK T183/Y185(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；抗ITGB1、4、7(武漢三鷹生物科技有限公司)；極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；總RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)

1.3 免疫組化將石蠟樣品制成5 μm切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟。然后通過浸泡在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進行抗原修復。之后將切片浸入3%過氧化氫中以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶。在室溫下濕盒中用5%山羊血清封閉。一抗TNC(1 ∶100)4 ℃孵育過夜。 洗滌3次后，二抗山羊抗兔(1 ∶2 000)37 ℃下孵育1 h。之后切片洗滌并用蘇木精復染，然后脫水并封片。

1.4 細胞培養(yǎng)人胃癌細胞系MGC803 SGC7901 NCI-N87(102155)、MKN28(338339)和AGS(102154)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。其中，GES-1 AGS NCI-N87細胞用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)，其他細胞在含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)。所有細胞都在維持37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 構建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系使用(http://crispr.mit.edu)在線設計工具設計引導RNA(guide RNA, gRNA)，選擇具有高特異性的3對gRNA，見表1。合成的引物退火，PCR反應條件為90 ℃、4 min；75 ℃、5 min；65 ℃、15 min；25 ℃、20 min。然后用BBSI酶消化pSpcas(BB)-2A-puro載體。將酶切后的載體與退火的引物在22 ℃下連接2 h或16 ℃過夜。載體構建完成篩選正確后，通過Lipofectamine 2000將它們轉(zhuǎn)染到SGC7901細胞中，然后用嘌呤霉素篩選TNC缺陷的SGC7901細胞系作為敲除(konck out, KO)組。同時設計非靶向的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901作為MOCK對照組，正常的SGC7901作為正常對照(control，CN)組。篩選后，收集培養(yǎng)基用于Western blot驗證。設計的3對gRNA中第1對具有最佳的敲除效果。

表1 gRNA

1.6Westernblot收集細胞和培養(yǎng)基并加入蛋白上樣緩沖液以制備蛋白質(zhì)樣品。然后使用10%SDS-PAGE進行凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉，在室溫下孵育2 h或在4 ℃下孵育過夜。然后孵育一抗，抗磷酸化AKT(Ser 473,1 ∶1 000)；抗AKT(1 ∶1 000)；抗磷酸-JNK(T183/Y185)(1 ∶500)；抗JNK(1 ∶500)；抗磷酸化ERK(T202/Y204,1 ∶1 000)；抗ERK(1 ∶1 000)；抗整合素β1、4、7(1 ∶500)；抗-ITGB5、8(1 ∶1 000)用含1%牛奶的TBST稀釋4 ℃孵育過夜。然后加入足量的抗IgG二抗(抗小鼠或抗兔IgG)，用2.5%脫脂牛奶1 ∶5 000稀釋于TBST中。將膜在室溫下孵育2 h并用TBST洗滌，顯影。

1.7 軟瓊脂生長實驗首先將1.2%瓊脂糖凝膠與2×DMEM以1 ∶1的比例混合，并將10 ml混合物倒入10 cm培養(yǎng)皿中。冷卻并凝固后，放入CO2培養(yǎng)箱備用。接下來將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化并輕輕吸打它們以制備單個細胞，進行活細胞計數(shù)。之后在無菌試管中以1 ∶1的比例混合0.7%瓊脂糖和2×DMEM，然后加入細胞懸浮液并充分混勻注入培養(yǎng)皿中，并逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂固化后，將其置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2周，每2～3 d加入培養(yǎng)基以防止其過于干燥。兩周后用結(jié)晶紫染色。染色2 h后，用脫色液脫色直至克隆可見。

1.8RT-PCR選取SGC7901TNC-/-細胞系和對照組SGC7901細胞，用天根總RNA提取試劑盒提取RNA，RNA提取后先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進行RT-PCR。PCR中使用的引物見表2。

表2 PCR引物

1.9 統(tǒng)計學處理采用Graphpad進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TNC在胃癌組織和細胞系中的表達TNC蛋白在正常和惡性胃黏膜組織中的表達狀態(tài)。使用免疫組織化學染色方法檢測了18個胃腺癌及其癌旁正常黏膜組織中的TNC蛋白。來自12個胃腺癌的組織顯示較強的TNC染色信號并且主要集中在細胞外間隙。在相同條件下，在正常胃黏膜組織中未檢測到陽性TNC免疫染色信號，見圖1A、1B。研究結(jié)果表明TNC在胃腺癌中的表達增加，并且它可能促進GC的發(fā)展和進程，因為蛋白質(zhì)的較高表達水平通常代表其在該腫瘤中促進腫瘤作用的線索。為了進一步了解GC中TNC的功能，研究了其在培養(yǎng)的胃癌細胞系中的行為，以確認其在細胞培養(yǎng)水平中的腫瘤促進作用。在正常胃上皮細胞系GES-1細胞中未檢測到TNC蛋白，而在5種檢測的GC細胞系中發(fā)現(xiàn)到其中有4個細胞系明顯存在TNC蛋白，其中SGC7901細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平最高，因此用于以下實驗，見圖1C。

圖1 TNC在組織和細胞系中的表達情況 SP×200

A：GC組織；B：癌旁組織；C：不同GC細胞和胃黏膜細胞

2.2 SGC7901細胞的軟瓊脂生長依賴于TNC表達將SGC7901和SGC7901TNC-/-細胞均以每孔103個細胞的濃度接種到6孔板中的軟瓊脂中，并在接種2周后進行菌落計數(shù)。發(fā)現(xiàn)正常的SGC7901細胞每孔平均形成126.37個菌落，而即使延長時間觀察，在培養(yǎng)良好的SGC7901TNC- /-細胞中基本無菌落，見圖2。這些結(jié)果意味著TNC對SGC7901細胞的錨定非依賴性生長具有必要的作用。

2.3 TNC敲除抑制了多種促進生長的信號傳導途徑Western blot結(jié)果顯示在SGC7901TNC-/-細胞中AKT、JNK和ERK的表達水平與SGC7901細胞中無顯著性差異，而AKT和JNK磷酸化蛋白的水平顯著降低，見圖3。結(jié)果表明缺乏TNC導致關鍵蛋白的失活，從而抑制這些促進細胞生長的信號通路中蛋白的激活。

圖2 敲除TNC組和對照組SGC7901 軟瓊脂集落形成對比1:第1次實驗結(jié)果；2：第2次實驗結(jié)果；3：第3次實驗結(jié)果

圖3 JNK、AKT和ERK蛋白總表達量和磷酸化蛋白量表達情況

CN：正常SGC7901對照；KO：TNC缺陷SGC7901細胞系(SGC7901TNC-/-);MOCK：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)?？瞻讓φ?與MOCK組比較：***P<0.001；與CN組比較：###P<0.001

2.4 TNC KO降低SGC7901細胞中ITGB7的表達Western blot檢測了SGC7901和SGC7901TNC-/-細胞中整聯(lián)蛋白的所有β亞基的表達，發(fā)現(xiàn)整合素β7(integrin β7， ITGB7)的蛋白表達明顯降低，且通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)ITGB7 mRNA僅存在于SGC7901細胞中，但不存在于SGC7901TNC-/-細胞中，而整聯(lián)蛋白其他β亞基在兩種細胞系中mRNA水平中均未顯示出顯著性差異，Western blot僅檢測出5種整聯(lián)蛋白。見圖4。

圖4 整合蛋白β亞型在蛋白和mRNA水平的表達量

A：整合蛋白β亞型在蛋白水平的表達量；B：蛋白條帶灰度值的定量分析；C：整合蛋白β亞型在mRNA水平的表達情況；CN：正常SGC7901對照；KO：TNC缺陷SGC7901細胞系(SGC7901TNC-/-)；MOCK：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)?？瞻讓φ?與MOCK組比較：***P<0.001；與CN組比較：###P<0.001

3 討論

TNC已被證明與許多不同的癌癥有關，其過表達在癌癥診斷和預后方面具有許多功能和臨床意義[8]。有研究[9]表明TNC表達增加與GC預后呈正相關。本研究進一步證實了GC組織中的TNC表達量比癌旁組織中表達高。同時在培養(yǎng)的GC細胞培養(yǎng)基中檢測到TNC蛋白，而未從正常的胃黏膜上皮細胞中檢測到TNC蛋白。陽性表達通常提示為癌癥的潛在標志物，因此該研究結(jié)果支持TNC作為早期檢測GC的有價值的生物標志物。

作為多種細胞功能和表型的調(diào)節(jié)劑，TNC可以調(diào)控多種細胞信號傳導和基因表達。TNC在不同類型的癌癥中具有不同的作用，如乳腺癌、骨髓干細胞和胰腺癌等分別與生存、增殖、轉(zhuǎn)移和遷移有關[7,10-12]。為了研究TNC在GC細胞中的作用，使用基因編輯技術產(chǎn)生了TNC缺陷的SGC7901細胞系(SGC7901TNC-/-)?；虻娜笔ǔе履[瘤細胞的生長缺陷，但是當在正常條件下培養(yǎng)SGC7901TNC-/-和正常SGC7901細胞時，沒有觀察到生長差異。因此，著重研究了TNC敲除對軟瓊脂中SGC7901細胞生長的影響。本研究主要發(fā)現(xiàn)胃癌SGC7901細胞中TNC敲除后導致其在軟瓊脂中的集落形成能力完全喪失，提示其功能是參與GC生長。正常的細胞一般需要依附在一定的基質(zhì)上面才能生長，一旦脫離基質(zhì)就會成為球狀從而不能增殖，而腫瘤細胞和癌變轉(zhuǎn)化細胞能夠在這種狀態(tài)下生長，而錨定非依賴性生長是惡性細胞的關鍵特征之一，因此TNC缺陷細胞在軟瓊脂中的生長缺陷說明了其在促進細胞增殖或維持惡性狀態(tài)中的必要性。作為細胞外因子，可以通過治療性抗體或其他藥物有效的阻斷TNC效應，因此開發(fā)TNC相關藥物可能是發(fā)展GC新的診斷、治療和生物工具的一種潛在途徑。

研究[12]發(fā)現(xiàn)許多細胞內(nèi)生物級聯(lián)反應參與激活TNC的致癌活性。例如，TNC通過激活JNK/c-Jun信號通路[10]誘導胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移、抗凋亡和侵襲，并通過增強AKT磷酸化促進軟骨細胞的存活等。假設TNC可以通過在這些生長促進途徑上起作用來促進和維持SGC7901細胞的惡性特征，那么TNC的喪失將會導致SGC7901細胞在軟瓊脂中的生長缺陷。基于該假設，在SGC7901細胞中敲除TNC后，這些生長信號傳導途徑至少有一種會受到影響。為了證實這一設想，通過Western blot分析了SGC7901和SGC7901TNC-/-細胞中AKT、JNK、ERK及其相應的磷酸化同種型的表達。類似地，在SGC7901細胞中的結(jié)果表明，敲除TNC導致AKT和JNK的磷酸化顯著降低，表明多種信號傳導途徑負責維持TNC致癌活性。TNC含有表皮生長因子樣重復序列和N末端多達17個纖連蛋白Ⅲ型樣重復序列的區(qū)域，它可以直接與整聯(lián)蛋白和EGFR家族受體相互作用，以激活多種細胞內(nèi)信號通路?？紤]到SGC7901TNC-/-細胞的生長缺陷歸因于多種生長信號傳導途徑，首先關注到的是EGFR家族受體，因為它們在細胞增殖控制中起重要作用，然而在SGC7901細胞中未檢測到EGFR家族受體表達異常。之后聚焦于是否TNC的缺失影響了整合素的表達。在TNC敲除的情況下，發(fā)現(xiàn)ITGB7的表達在蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著降低。雖然目前尚不清楚為什么TNC敲除導致ITGB7在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的下調(diào)，推測出TNC和ITGB7之間可能存在反饋回路，因此TNC的缺失可能導致ITGB7內(nèi)吞作用進入細胞以抑制其轉(zhuǎn)錄水平的表達。雖然整合素是TNC信號的主要轉(zhuǎn)導因子之一，但ITGB7是否介導TNC對胃癌SGC7901細胞的錨定非依賴性生長仍需進一步研究。