王 秀，管世鶴，陳禮文，楊 凱，張 浩，汪 靜，王兆飛

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]，約40%的HCC患者在確診時(shí)伴有門靜脈癌栓(portal vein tumor thrombus, PVTT)[2]，PVTT是影響HCC預(yù)后的重要因素。如果不治療，中位生存期只有2.7～4個(gè)月[3]。研究表明40%～50%的患者在早期HCC診斷中，處于可接受治療的階段[4]，甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP) 作為肝癌的經(jīng)典血清標(biāo)志物，仍有30%左右的肝癌患者血清AFP為陰性，而在部分良性肝病患者AFP也會(huì)升高[5]。臨床上PVTT診斷多通過影像學(xué)輔助檢查，因此尋找新的血清標(biāo)志物對(duì)AFP陰性的肝癌患者及PVTT輔助診斷具有重要的臨床價(jià)值。

維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ)即異常凝血酶原，用于肝癌高危人群篩查和HCC的診斷[6]，尤其是AFP陰性的肝癌患者[7]。此外，血清和組織中高表達(dá)的PIVKA-Ⅱ已經(jīng)證實(shí)與微血管侵犯有關(guān)[8-9]，而微血管侵犯是PVTT形成的早期階段。目前關(guān)于PVTT的血清學(xué)標(biāo)志物研究較少，該研究旨在分析PIVKA-Ⅱ在肝癌中的診斷價(jià)值尤其是在HCC高危人群篩查和AFP陰性的肝癌中輔助診斷價(jià)值，同時(shí)探討在PVTT診斷中的臨床指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料2017年5月～2018年5月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院患者或體檢者，按研究目的分為3組：① 經(jīng)確診的HCC初診患者56例(包括PVTT組21例，未合并PVTT組35例)，其中男50例，女6例，年齡28～82(56.14±13.39)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝移植病史；肝癌合并其他癌癥。② 同期住院的32例慢性肝病患者，其中男24例，女8例，年齡23～76(55.08±13.11)歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》，排除合并其他類型肝炎的病例或《2015 JSGE循證臨床實(shí)踐指南：肝硬化》。③ 同期體檢健康者30例，其中男22例，女8例，年齡25～75(53.89±12.56)歲。各項(xiàng)指標(biāo)均正常，B超排除腹部疾病。三組在年齡和性別上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。患者及健康人均未服用華法林抗凝劑、維生素K及維生素 K拮抗劑類藥物。通過我院病案室電子病歷系統(tǒng)和病理科數(shù)據(jù)庫查詢HCC患者臨床病理資料。

表1 各組血清PIVKA-Ⅱ和AFP水平比較[M(P25，P75)]

表2 血清PIVKA-Ⅱ和AFP水平與HCC病理學(xué)特征的關(guān)系[M(P25，P75)]

1.2 標(biāo)本采集檢測(cè)所需靜脈血液標(biāo)本均在患者手術(shù)、介入或其他治療前(體檢健康者于體檢時(shí))采集，3 500 r/min離心10 min，分離血清，標(biāo)本均無溶血、黃疸、脂血等，在2 h內(nèi)完成各生化指標(biāo)檢測(cè)，不能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本置-20 ℃保存。

1.3 主要儀器與試劑ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及PIVKA-Ⅱ化學(xué)發(fā)光法試劑盒、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品(日本富士瑞必歐株式會(huì)社)；Roche e601電化學(xué)發(fā)光分析儀的AFP配套的試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品(瑞士羅氏公司)；VEGFA試劑(深圳達(dá)科為公司)；KHB-ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A公司)。

1.4 各生化指標(biāo)檢測(cè)用生化分析儀及配套的試劑盒檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，NADH法)、總膽紅素(T-Bil，重氮試劑法)、清蛋白(Alb，溴甲酚綠法)、總蛋白(TP，雙縮脲法)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。分析前各組數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)均采用Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)。偏態(tài)數(shù)據(jù)以M(P25，P75)表示。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。HCC診斷效能用敏感性、特異性和臨界值，并構(gòu)建ROC曲線，ROC-AUC之間比較用Z檢驗(yàn)。Logistic回歸分析計(jì)算血清PIVKA-Ⅱ、VEGFA和AFP水平預(yù)測(cè)PVTT的OR值和95%CI。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PIVKA-Ⅱ和AFP在各組中水平比較PIVKA-Ⅱ和AFP在HCC組血清表達(dá)水平顯著高于慢性肝病組和健康對(duì)照組(PIVKA-Ⅱ:U=137.0、187.0，AFP:U=323.0、125.0，P均<0.01)。見表1。

2.2 血清PIVKA-Ⅱ和AFP診斷HCC效能以不同對(duì)照組繪制ROC曲線，見圖1。以慢性肝病組為對(duì)照，PIVKA-Ⅱ的ROC曲線下面積為0.918，95%CI:0.839～0.966，均高于AFP的0.808，95%CI: 0.709～0.885；以慢性肝病組或非肝癌組(健康人+慢性肝病組)為對(duì)照，PIVKA-Ⅱ特異度均高于AFP，且兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)會(huì)提高其特異度而不降低其敏感度。以非肝癌組(健康人+慢性肝病組)為對(duì)照，19例AFP陰性 (血清AFP≤20 ng/ml)肝癌患者為病例組，PIVKA-Ⅱ的ROC曲線下面積為0.882,95%CI: 0.789～0.945，當(dāng)PIVKA-Ⅱ的cut-off值為45.88 mAu/ml時(shí)，敏感度和特異度分別為78.95%和100%。

2.3 血清PIVKA-Ⅱ和AFP水平與HCC病理學(xué)特征的關(guān)系HCC組PIVKA-Ⅱ和AFP血清表達(dá)水平在HCC組多發(fā)結(jié)節(jié)、腫瘤直徑≥5 cm、重度MVI組顯著升高(P均<0.05)。見表2。

2.4 兩組血清中PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGFA的水平比較PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGFA在PVTT組中表達(dá)水平顯著高于HCC未合并PVTT組(P均<0.05)。見表3。

2.5 PVTT的預(yù)測(cè)因素分析單因素分析PVTT的預(yù)測(cè)因素血清PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGFA有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多因素分析血清VEGFA (OR=2.919,95%CI:1.118～7.170,P=0.019)，PIVKA-Ⅱ(OR=2.997, 95%CI:1.217～7.381,P=0.017)和AFP (OR=2.819, 95%CI:1.318～7.370,P=0.014)是PVTT獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。見表4。

圖1 PIVKA-Ⅱ和AFP檢測(cè)肝癌的ROC曲線

A:以慢性肝病組為對(duì)照，HCC組為病例組;B:以健康人+慢性肝病組為對(duì)照，HCC組為病例組;C:以健康人+慢性肝病組為對(duì)照，AFP陰性HCC組為病例組

2.6 血清PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGFA診斷PVTT效能以HCC未合并PVTT組為對(duì)照，繪制ROC曲線，見圖2。結(jié)果顯示，PIVKA-Ⅱ的特異度(91.43%)高于AFP和VEGFA，聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積(0.844)均高于單項(xiàng)檢測(cè)，PIVKA-Ⅱ與 AFP和VEGFA的ROC曲線下面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.564、0.419，P>0.05)，見表5。

圖2 單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)診斷PVTT的ROC曲線

3 討論

HCC是全球常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差。我國病死率一直居高不下，現(xiàn)階段臨床上仍以“B超+AFP”作為肝癌的常規(guī)篩查手段，使部分肝癌在亞臨床階段難以診斷。本研究顯示，HCC組PIVKA-Ⅱ水平顯著高于慢性肝病組和健康對(duì)照組(P<0.05)，與AFP不同的是，慢性肝病組PIVKA-Ⅱ水平較健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這表明PIVKA-Ⅱ在HCC和慢性肝病鑒別診斷方面優(yōu)于AFP，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道相似。并且PIVKA-Ⅱ的ROC曲線下面積和特異度均高于AFP，表明其在肝癌的診斷價(jià)值高于AFP，且兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)會(huì)提高其特異度而不降低敏感度，國內(nèi)外學(xué)者也有報(bào)道[10-11]。PIVKA-Ⅱ?qū)FP陰性的肝癌患者亦有補(bǔ)充診斷價(jià)值，以AFP陰性HCC作為病例組，當(dāng)PIVKA-Ⅱ的cut-off 值為45.88 mAu/ml時(shí)，其敏感度和特異度分別為78.95%和100%。血清PIVKA-Ⅱ能較好地反映HCC病理特征及預(yù)后，本研究中血清PIVKA-Ⅱ水平隨腫瘤直徑變大、結(jié)節(jié)數(shù)目增多、重度MVI形成而升高(P均<0.01)，與以往研究[7]一致。

表3 兩組血清PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGFA水平比較[M(P25，P75)]

表4 PVTT的預(yù)測(cè)因素

表5 血清PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGFA診斷PVTT的AUC-ROC比較

有研究[12-13]表明血清中的AFP和VEGFA是肝癌易發(fā)生PVTT的危險(xiǎn)指標(biāo)。為進(jìn)一步明確血清PIVKA-Ⅱ?qū)Ω伟┌l(fā)生PVTT的臨床預(yù)測(cè)價(jià)值，本研究通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血清高PIVKA-Ⅱ水平是PVTT獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，同時(shí)PIVKA-Ⅱ的特異度(91.43%)高于AFP和VEGFA，且聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積(0.844)均高于單項(xiàng)檢測(cè)，這表明血清PIVKA-Ⅱ疾病特異性高，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PVTT 診斷具有重要的臨床價(jià)值。

目前研究顯示PIVKA-Ⅱ是PVTT良好的預(yù)測(cè)因子，然而血清中高表達(dá)的PIVKA-Ⅱ與PVTT形成的機(jī)制的關(guān)系尚不明確。PVTT的生長需要豐富的血管提供充足的氧氣和營養(yǎng)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，體外實(shí)驗(yàn)顯示PIVKA-Ⅱ能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和上皮生長受體(EGFR)過表達(dá)，同時(shí)也能促進(jìn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGFA，而VEGFA在血管生成中發(fā)揮著重要的作用[14-15]。肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的PIVKA-Ⅱ可能通過促進(jìn)VEGFA生成在血管新生過程中發(fā)揮著重要作用，而其在PVTT發(fā)生發(fā)展中扮演的角色需要進(jìn)一步研究探討。

總之，高水平PIVKA-Ⅱ?qū)CC高危人群篩查、AFP陰性肝癌診斷具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值，尤其是對(duì)HCC患者發(fā)生PVTT的輔助診斷。