王 安，顧正宇，廖榮豐，帥宗文

前期研究[1]已經(jīng)證實(shí)不伴有繼發(fā)性干燥綜合征(secondary Sj?gren's syndrome, sSS)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者的干眼發(fā)病率及嚴(yán)重程度與SLE的活動度相關(guān)，然而具體機(jī)制尚不明確。為了進(jìn)一步探索影響此類患者發(fā)生干眼的因素，該實(shí)驗(yàn)擬研究血清細(xì)胞因子與此類患者干眼臨床體征的相關(guān)性。

基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，它在炎癥、傷口的愈合和細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用。在干眼小鼠模型中，MMP-2參與到干眼的發(fā)生發(fā)展中[2]。白介素(interleukin，IL)-1，IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)屬于前炎癥因子，干眼人群淚液中的IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的濃度較健康對照組升高[3]，并且這些細(xì)胞因子與干眼的臨床指標(biāo)呈現(xiàn)密切相關(guān)性[4]。激肽釋放酶13(kallikrein 13， Klk13)是激肽系統(tǒng)的主要限速酶，對血壓、電解質(zhì)及炎癥反應(yīng)均有調(diào)節(jié)作用。關(guān)于Klk13對于干眼的影響尚無統(tǒng)一定論，該研究將Klk13作為一個候選細(xì)胞因子納入此項(xiàng)研究。

1 材料與方法

1.1 患者入選標(biāo)準(zhǔn)診斷符合SLE且不伴有其他的自身免疫性疾病，通過抗干燥綜合征A抗體 (S?gren's syndrome A antibody, anti-SSA antibody)和抗SSB抗體排除干燥綜合征患者，并且這些患者否認(rèn)口干病史。患者過去1周無眼藥水使用史，無角膜接觸鏡佩戴史。患有白內(nèi)障、玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離、翼狀胬肉、角膜新生物、瞼板腺功能障礙等疾病將從研究對象中去除。根據(jù)2017年淚膜眼表協(xié)會和干眼世界工作組II (tear film & ocular surface society and dry eye workshop II, TFOS DEWS II)干眼診斷共識，將納入研究的患者分為3組：眼表疾病指數(shù)(ocular surface disease index，OSDI)≥13且淚膜破裂時間(tear film break-up time，TBUT)<10 s定義為干眼組(n=11)，OSDI≥13或TBUT<10 s定義為干眼傾向組(n=25)，OSDI<13且TBUT≥10 s定義為對照組(n=18)。

1.2 干眼指標(biāo)的測定淚河高度，第1次淚膜破裂時間和平均淚膜破裂時間通過眼表綜合分析儀keratograph 5M(德國Oculus公司)測定。患者的干眼癥狀通過國際公認(rèn)的OSDI量表評估。

1.3 主要試劑MMP-2一抗、Klk13一抗、IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自美國R&D systems公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒購自海門市碧云天生物技術(shù)研究所；β-actin一抗、二抗購自北京中杉金橋公司。

1.4 主要儀器酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；電泳、轉(zhuǎn)膜、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1血液樣本的收集及準(zhǔn)備 患者的外周靜脈血通過采血針收集到5 ml含有EDTA-K2抗凝劑的采血管中，將采血管放入高速離心機(jī)中以3 000 r/min離心5 min致使血清及血細(xì)胞上下分層，將上層血清分離到1.5 ml EP管中，勿吸到下層血細(xì)胞。將上述分離的血清放入-80 ℃冰箱凍存，以備進(jìn)行下一步檢測。

1.5.2Western blot檢測MMP-2、Klk13在各組中的相對蛋白表達(dá)量 通過BCA法測量蛋白濃度，調(diào)整蛋白上樣量使每孔加入的蛋白總量相同。樣品用上樣緩沖液及巰基乙醇處理。10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，300 mA的電流恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成后，按照所需蛋白分子量大小將PVDF膜切割成相應(yīng)大小，再將這些膜放入5%的脫脂奶粉中完成封閉。將含有目的蛋白的膜與相應(yīng)1 ∶1 000抗體在4 ℃下孵育12 h，TBST漂洗3次，每次10 min，再將膜放入含有1 ∶5 000二抗的溶液中振搖2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，再向膜上加ECL顯色液在X光下膠片曝光。β-actin被用作內(nèi)參。Image J用來測量圖片的灰度值，用目的蛋白/β-actin代表目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5.3ELISA法測量IL-1、IL-6、TNF-α在各組中的濃度 嚴(yán)格按照R&D公司的ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照各濃度梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，取100 μl血清樣品加入各個抗體包被好的孔中室溫孵育2 h，蓋上封口膜以防污染，之后用洗板機(jī)洗板，再向各孔中加入200 μl酶標(biāo)抗體，室溫孵育2 h，洗板機(jī)洗板，再向各孔中加入100 μl顯色液，孵育半小時后向各孔中加入50 μl終止液，加入終止液后半小時內(nèi)在酶標(biāo)儀下讀取450 nm的吸光度(optical density, OD)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出各樣本的蛋白濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0、Matlab 2017b進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用單因素方差分析比較3組之間的差異。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用Kruskal-Wallis test比較3組之間的差異。對于符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)間的相關(guān)分析，用Pearson相關(guān)分析，對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)間的相關(guān)分析，用Spearman相關(guān)分析。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人群基線比較分析了年齡、病程、性別、相關(guān)抗體等指標(biāo)在3組患者之間的差異，3組人群基本可比。在淚河高度(P<0.001)、第一次淚膜破裂時間(P<0.001)、平均淚膜破裂時間(P<0.001)、OSDI(P<0.001)這幾項(xiàng)指標(biāo)中，3組人群之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 Western blot檢測各組MMP-2、Klk13的結(jié)果MMP-2在3組之間呈漸進(jìn)性的改變，與對照組比較，干眼組患者血清中MMP-2的蛋白含量顯著升高，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016)。見圖1A、B。Western blot結(jié)果顯示，Klk13蛋白含量在3組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.621)。見圖1C。

2.3 ELISA法檢測3組患者中的IL-1、IL-6、TNF-α的含量比較3組患者血清中IL-1的濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，IL-1在干眼傾向組(209.52±263.27) ng/L的表達(dá)量最高，而在干眼組(114.87±169.86 )ng/L中的表達(dá)量反而降低。比較3組患者IL-6的血清濃度，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.268)。TNF-α在3組中呈梯度改變，干眼組(362.17±247.28 ) ng/L與對照組(122.65±125.38 ) ng/L之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。見圖2。

2.4 干眼指標(biāo)和炎癥因子的相關(guān)分析MMP-2與OSDI之間(r=0.328,P=0.001)存在正相關(guān)，IL-1與淚河高度(r=-0.358,P<0.001)、第1次淚膜破裂時間(r=-0.424,P<0.001)、平均淚膜破裂時間(r=-0.472,P<0.001)之間均存在負(fù)相關(guān)，TNF-α與淚河高度(r=-0.211,P=0.037)、平均淚膜破裂時間(r=-0.278,P=0.006)、OSDI(r=0.238,P=0.018)之間均存在相關(guān)性。Klk13與所有的干眼指標(biāo)均不存在相關(guān)性，IL-6與所有的干眼指標(biāo)也不存在相關(guān)性。見表2、圖3。

3 討論

本研究通過臨床干眼相關(guān)檢查指標(biāo)將不伴有sSS的SLE患者分為3組，分別探索各組患者外周血血清中細(xì)胞因子的含量及其與干眼指標(biāo)的相關(guān)性。

研究結(jié)果顯示，MMP-2在干眼組、干眼傾向組和對照組中呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，并且MMP-2在干眼組和對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，由此可認(rèn)為MMP-2參與到干眼的發(fā)生中。研究表明活性氧/環(huán)加氧酶2/超氧化物歧化酶1/過氧化物酶4通路[5]、Toll樣受體通路[6]在角膜上皮細(xì)胞模型中參與到干眼的發(fā)生過程中，并與MMP-2的升高可能有關(guān)聯(lián)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路可能與MMP形成惡性循環(huán)參與到干眼的形成過程中，抑制鞘氨醇-1-磷酸受體可能會打破MAPK和MMP形成的惡性循環(huán)，從而改善干眼狀況[7]。

研究[3]證實(shí)在干眼患者淚液中IL-1的表達(dá)量較對照組明顯增高，有研究[8]證實(shí)在干燥綜合癥小鼠模型的結(jié)膜和淚腺組織中，IL-1在蛋白水平和基因水平均較野生型對照組上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與之相符，證明IL-1參與到干眼的發(fā)病過程中。IL-1受體(IL-1R)在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用。IL-1與IL-1R結(jié)合后，募集IL-1R輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein, IL-1RAcP)以形成高親和力的IL-1R1/IL-1RAcP異二聚體受體，啟動下游炎癥級聯(lián)信號，例如核因子κB信號、MAPK信號等，這也許解釋了干眼傾向組與對照組之間的差別。然而干眼組與對照組之間無差別，可能原因是IL-1屬于早期炎癥因子，晚期抗炎癥因子細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活化釋放抗炎癥因子可拮抗炎癥因子的作用[9]。

表1 納入研究的SLE患者的基本資料

圖1 Western blot檢測3組患者血清中MMP-2、Klk13的相對表達(dá)量

圖2 ELISA檢測3組患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α的濃度

圖3 TNF-α的濃度與平均淚膜破例時間、淚河高度、OSDI的相關(guān)性

表2 SLE患者血清中細(xì)胞因子與干眼臨床資料的相關(guān)性

TNF-α是由1型輔助性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在抗原呈遞的過程中具有重要作用。研究[9-10]顯示，TNF-α在干眼動物模型的淚液、結(jié)膜、淚腺等組織的表達(dá)量較對照組明顯增高，這與本研究結(jié)果一致。此外，在干眼小鼠模型中，TNF-α阻斷劑能阻斷眼表的炎癥反應(yīng)并改善眼表癥狀[11]。從相關(guān)性分析可看出，TNF-α更適合作為干眼癥患者的血清學(xué)標(biāo)志物，因其與淚河高度、平均淚膜破裂時間、OSDI等干眼的相關(guān)指標(biāo)均具有相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示IL-6在3組之間無差別，這與Jackson et al[12]研究結(jié)果相同，但與Lin et al[13]研究結(jié)果不同。研究[14]證實(shí)IL-6在人角膜上皮細(xì)胞模型中的表達(dá)量在干眼組較對照組增高。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果不同的一個可能原因是選取的研究對象為SLE患者，這些患者的整體炎癥因子的水平較高，可能在3組之中的差別不明顯。此外，樣本量較小也是一個可能原因。

有研究[15]顯示在干眼小鼠模型的血清中可檢測到Klk13，而在野生對照組小鼠血清中無Klk13的存在。然而，在本研究中，3組患者血清中的Klk13無明顯差異，這可能與樣本的物種差異有關(guān)。

綜上所述，本研究測定了不同眼表狀況的不伴有sSS的SLE患者血清中相關(guān)細(xì)胞因子，結(jié)果顯示MMP-2、IL-1、TNF-α這些細(xì)胞因子參與到干眼的發(fā)生過程中，并且TNF-α可能可以作為診斷干眼的一個血清學(xué)指標(biāo)。本研究是首個探索MMP-2、Klk13、IL-1、IL-6、TNF-α在不伴有sSS的SLE患者血清中的含量與干眼臨床指標(biāo)相關(guān)性的研究。MMP-2、IL-1、TNF-α影響干眼發(fā)生的具體機(jī)制及通路是下一步需要探討的問題。