董育紅, 李遂焰， 陳渝萍

(1. 西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031； 2. 西南交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031； 3. 南華大學(xué) 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 衡陽(yáng) 421001)

當(dāng)前臨床治療亟待解決的難題是如何提高藥物治療療效并降低乃至去除其毒副作用，藥物的靶向性研究越來(lái)越受到重視[1-2]。纖維化疾病(包括系統(tǒng)性硬化、肺纖維化、肝硬化、進(jìn)展性腎病、骨髓纖維化等)病人的組織中異常沉積細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)，使組織變硬、順應(yīng)性降低，破壞組織器官的結(jié)構(gòu)和功能，危害人們的健康乃至生命[3-7]。其中，I型膠原蛋白的增多極為顯著[8-12]。人類胎盤生長(zhǎng)因子2(Placental Growth Factor，PlGF-2)的氨基酸123～144肽段(PlGF-2123-144)介導(dǎo)其對(duì)多種ECM蛋白尤其是對(duì)I型膠原蛋白的高親性[13]。這些研究結(jié)果啟發(fā)我們利用該短肽去修飾抗纖維化藥物，可使其獲得和I型膠原蛋白結(jié)合的能力，更易于為I型膠原蛋白豐富的纖維組織捕捉和留滯，進(jìn)而提高其療效。本研究對(duì)人PlGF-2123-144的編碼DNA序列進(jìn)行修改、構(gòu)建了GST-PlGF-2123-144融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，采用E.coliBL21原核系統(tǒng)進(jìn)行大量表達(dá)，親和純化獲得了具備和I型膠原蛋白高親性結(jié)合的GST-PlGF-2123-14融合蛋白，為進(jìn)一步研發(fā)靶向治療各種纖維化疾病的藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21購(gòu)自北京擎科公司；pMD19-T連接試劑盒和1 kb DNA Marker購(gòu)于大連寶生；PCR試劑盒，購(gòu)自天根或NEB-北京；DNA內(nèi)切酶和連接酶購(gòu)自NEB-北京；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟；膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen， SDS-PAGE蛋白電泳試劑耗材膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自BioRad。GST鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG分別來(lái)自Affinity Biosciences和Invitrogen；pGEX-4T-1質(zhì)粒和Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自GE Healthcare，L-還原性谷胱甘肽來(lái)自TOCRIS；溶菌酶、I型膠原蛋白購(gòu)自Sigma-Aldrich；引物由上海生工合成。其他國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1PlGF-2123-144基因片段的獲得

采用“JCat”軟件對(duì)人PlGF-2第123～144位氨基酸所對(duì)應(yīng)的DNA序列進(jìn)行修改、融入大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，設(shè)計(jì)出PlGF-2123-144序列。所用引物序列如下。 F：5′-GAATTCCGTCGTC GTCCGAAAGGTCGTGGTAAAC GTCGTCGTGAAAAACAG-3′和R:5′-GTCGACCAGGTGGCAGT CGGTCGGACGCTGTTTTTCACGACGACGTTTACC-3′。 以常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物與pMD19-T線性載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性菌落經(jīng)藍(lán)白篩選、克隆PCR和堿裂解法提取質(zhì)粒并以Hind Ⅲ 單酶切和最后的陽(yáng)性pMD19-PlGF-2123-144質(zhì)粒測(cè)序鑒定?？寺CR上游引物(5′-3′)：ATGCAGAATTCCGTCGTCGT(畫線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))；下游引物(5′-3′)：ACGTACTCGAGCAGGTGGCAGTCG(畫線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。

1.2.2 GST-PlGF-2123-144重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

以pMD19-PlGF-2123-144為模板，采用上述克隆PCR引物擴(kuò)增PlGF-2123-144基因片段。以EcoR I和XhoI分別對(duì)回收的PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、再分別以12% PAGE膠和0.8%瓊脂糖膠電泳分離和回收，T4DNA連接酶4 ℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。采用引物(上游引物(5′-3′)：GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG，下游引物(5′-3′)：CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG)進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性細(xì)菌，最后經(jīng)測(cè)序鑒定獲得GST-PlGF-2123-144融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。分別將pGEX-4T-1質(zhì)粒和重組pGEX4T1-PlGF-2123-144質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，獲得GST融合蛋白的工作菌種。

1.2.3 GST、GST-PlGF-2123-144蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

BL21單菌落接種于Amp+/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖過(guò)夜后，1∶1000稀釋到Amp+/2XYT培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD550=0.8。加入IPTG于30 ℃、250 r/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。對(duì)不同IPTG終濃度(0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L，誘導(dǎo)6 h)和不同誘導(dǎo)時(shí)間(2、4和6 h，1 mmol/L IPTG)的培養(yǎng)菌液進(jìn)行收集、裂解和Western Blot分析檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性條帶進(jìn)行光密度掃描分析，確定最優(yōu)表達(dá)條件。

使用最優(yōu)條件大量誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集細(xì)菌以溶菌酶裂解，離心取上清。上清(相當(dāng)于20 mL菌液)中的目的蛋白經(jīng)Glutathione Sepharose 4B膠泥親和吸附和10 mmol/L還原性谷胱甘肽(pH 8.0)洗脫。以考馬斯亮藍(lán)染色和Western Blot分析追蹤GST融合蛋白的純化情形。洗脫的目的蛋白以含10%甘油及0.01 mmol/L DTT的PBS溶液進(jìn)行透析并以BCA方法定量。

1.2.4 融合蛋白對(duì)I型膠原蛋白的親和活性的ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定

按照?qǐng)D1所示流程進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。ELISA孔板首先用100 μL I型膠原蛋白包埋4℃ 過(guò)夜、干燥過(guò)夜，隨后脫脂牛奶進(jìn)行封閉?？装迤春笤俜謩e加入 GST融合蛋白和膠原蛋白共孵育。漂洗后加入GST一抗(1∶5000)4 ℃孵育過(guò)夜檢測(cè)滯留的GST蛋白。二抗孵育后,加入0.3% H2O2甲醇溶液封閉、進(jìn)行常規(guī)顯色。讀取各孔450 nm處OD值并計(jì)算GST信號(hào)。

圖1 ELISA實(shí)驗(yàn)流程示意圖

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用TTEST檢驗(yàn)方法比較同等摩爾數(shù)的GST和GST-PlGF-2123-144蛋白的組間差異，P< 0.05表示組間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PlGF-2123-144基因片段的獲得

采用各含部分PlGF-2123-144DNA序列的兩段引物進(jìn)行退火和PCR擴(kuò)增，獲得含PlGF-2123-144序列的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2-A)；隨后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選白色菌落進(jìn)行菌落PCR，2%瓊脂糖凝膠電泳顯示100 bp處有一條特異性條帶，與PlGF-2123-144(88 bp)片段大小基本相符(圖2-B)。提取陽(yáng)性細(xì)菌質(zhì)粒，使用Hind Ⅲ 進(jìn)行單酶切。圖2-C的0.8%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，1泳道1.9 kb 的未線性化質(zhì)粒在單酶切后產(chǎn)生約2.7 kb的片段，和pMD19-PlGF-2123-1442770 bp的大小符合(2號(hào)泳道)。測(cè)序結(jié)果顯示PlGF-2123-144目的DNA序列成功克隆到pMD19質(zhì)粒(圖2-D)。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

以pMD19-PlGF-2123-144為模板擴(kuò)增PlGF-2123-144片段，酶切后插入pGEX4T1表達(dá)質(zhì)粒。圖3-A是pGEX4T1-PlGF-2123-144質(zhì)粒菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。與陰性對(duì)照對(duì)比，陽(yáng)性重組質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生了一條單一擴(kuò)增條帶，位置非常接近229 bp目標(biāo)片段。圖3-B的測(cè)序結(jié)果證實(shí)了PlGF-2123-144的DNA序列被成功克隆到pGEX4T1質(zhì)粒。圖3-C和D分別是pGEX4T1和pGEX4T1-PlGF-2123-144轉(zhuǎn)化E.coliBL21后質(zhì)粒酶切的鑒定結(jié)果：EcoR I單酶切產(chǎn)生的約5 kb單一片段在結(jié)合EcoR V進(jìn)行雙酶切后，可被斷裂為2和3 kb大小的兩個(gè)片段，表明兩種pGEX4T1質(zhì)粒均被成功導(dǎo)入E.coliBL21。

A：PlGF-2123-144序列的PCR擴(kuò)增；B：pMD19-PlGF-2123-144菌落PCR；C：pMD19-PlGF-2123-144質(zhì)粒單酶切；D：pMD19-PlGF-2123-144測(cè)序

圖2pMD19-PlGF-2123-144質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

Figure 2 Construction and characterization of pMD19-PlGF-2123-144plasmid

A：菌落PCR；B：測(cè)序結(jié)果；C：pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化BL 21酶切結(jié)果；D：pGEX4T1-PlGF-2123-144轉(zhuǎn)化BL 21酶切鑒定結(jié)果

圖3重組質(zhì)粒pGEX4T1-PlGF-2123-144質(zhì)粒鑒定和轉(zhuǎn)化BL21鑒定結(jié)果

Figure 3 Identification and transformation of BL21 by recombinant plasmid pGEX4T1-PlGF-2123-144

2.3 GST和GST- PlGF-2123-144蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

以30 ℃為誘導(dǎo)溫度，探索IPTG誘導(dǎo)濃度(0.1～4 mmol/L)和誘導(dǎo)時(shí)間(1～4 h)對(duì)兩種GST蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響。如圖4-A所示，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后，GST的蛋白產(chǎn)量和在細(xì)菌裂解上清中的所占比例都已達(dá)到較好水平。圖4-B的Western Blot分析結(jié)果則顯示了GST-PlGF-2123-144蛋白在不同條件下都有較好的誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)目的蛋白陽(yáng)性條帶進(jìn)行光密度掃描定量分析，發(fā)現(xiàn)1 mmol/L IPTG時(shí)，不同誘導(dǎo)時(shí)間樣品的光密度分別為3734.95、5358.32、7231.04和7681.65，說(shuō)明蛋白產(chǎn)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增多。當(dāng)設(shè)定誘導(dǎo)時(shí)間6 h，不同IPTG濃度下樣品的光密度分別為8895.96、7990.42、7681.65、6246.76和8078.79，蛋白產(chǎn)量在0.1 mmol/L IPTG時(shí)最高，0.5和1 mmol/L時(shí)降低10%，2 mmol/L時(shí)則降了近30%，表明IPTG過(guò)高對(duì)GST-PlGF-2123-144蛋白產(chǎn)量有負(fù)面影響。進(jìn)一步分析誘導(dǎo)6 h后目的蛋白在裂解上清和沉淀中的分配比例，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)IPTG濃度為0.1、0.5、1、2 和4 mmol/L時(shí)，目的蛋白的分配比例依次為1.21、1.07、1.08和1.00(其中4 mmol/L沉淀樣品不具備分析性未進(jìn)行分析)。因此，在30 ℃、0.1 mmol/L IPTG和6 h的誘導(dǎo)條件下，可溶性GST-PlGF-2123-144蛋白產(chǎn)量可達(dá)最高。

通過(guò)對(duì)細(xì)菌總蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，我們比較了GST和GST-PlGF-2123-144融合蛋白表達(dá)產(chǎn)量。圖5-B為來(lái)自相同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件(1 mmol/L IPTG，6 h)下等量菌液中兩種蛋白的表達(dá)結(jié)果。占細(xì)菌總蛋白41%的是GST蛋白，GST-PlGF-2123-144蛋白所占比例有所下降，約為34%；而GST-PlGF-2123-144蛋白表達(dá)量約為GST蛋白的83%。

A：GST蛋白；B：GST-PlGF-2123-144蛋白

圖4GST和GST-PlGF-2123-144蛋白的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件的WesternBlot分析

Figure 4 Western Blot assay for optimization of the induced GST and GST-PlGF-2123-144proteins

2.4 GST和GST- PlGF-2123-144蛋白的純化

大量誘導(dǎo)表達(dá)GST和GST-PlGF-2123-144蛋白后，采用Glutathione Sepharose 4B親和性膠泥純化可溶性目的蛋白，并在每個(gè)純化步驟完成后取少量樣品、進(jìn)行了SDS-PAGE和Western Blot分析。圖5考馬斯亮藍(lán)染色定量分析，GST洗脫液的純度分別為96%、98%和99%。GST-PlGF-2123-144的純度從72%、86%到97%。Western Blot結(jié)果顯示，膠泥親和吸附的GST蛋白在3次洗脫后已經(jīng)從膠泥上脫吸附，而GST-PlGF-2123-144則需要更多的洗脫操作來(lái)保證充分回收。通過(guò)Glutathione Sepharose 4B膠泥親和吸附，我們很好地純化兩種目的蛋白。

A：GST蛋白；B：GST- PlGF-2123-144蛋白

圖5純化的GST和GST-PlGF-2123-144蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色和WesternBlot分析

Figure 5 Coomassie blue staining and Western Blot analysis of the prepared GST and GST-PlGF-2123-144

2.5 ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定GST- PlGF-2123-144融合蛋白對(duì)I型膠原蛋白的親和活性

往I型膠原蛋白充分包被的96孔ELISA孔板中分別加入摩爾數(shù)相同的GST和GST-PlGF-2123-144兩種蛋白與I型膠原蛋白孵育，檢測(cè)目的蛋白活性。如圖6所示，和膠原蛋白孵育的GST蛋白即使從0.5 μmol增加到了6 μmol，孔板中GST的ELISA信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有改變；而當(dāng)GST-PlGF-2123-144加入量增加到3 μmol和6 μmol時(shí)，孔板中GST的ELISA信號(hào)強(qiáng)度高出同等摩爾數(shù)GST蛋白組5.1倍(P=0.0291)和5.75倍(P=0.0131)。這個(gè)結(jié)果證實(shí)，GST-PlGF-2123-144融合蛋白的確具有良好的和I型膠原蛋白結(jié)合的活性。

圖6 ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定GST-PlGF-2123-144融合蛋白對(duì)I型膠原蛋白的親和活性

3 討論

纖維化的組織中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β刺激纖維母細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等[14]大量分泌I型膠原蛋白，同時(shí)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑抑制膠原蛋白酶，使得I型膠原蛋白大量沉積[7-12]。這一特點(diǎn)使得I型膠原蛋白可以作為一個(gè)很好的靶向纖維化組織的靶點(diǎn)。近來(lái)研究顯示，PlGF-2123-144肽段對(duì)多種ECM蛋白(尤其是I型膠原蛋白)具有很強(qiáng)的親和結(jié)合活性，可使與其融合的細(xì)胞因子在組織中滯留、富集，提高細(xì)胞因子功效。已有研究表明，與PlGF-2123-144肽段融合后的PDGF-BB和VEGF-A細(xì)胞因子在治療小鼠的體外創(chuàng)傷上顯示出更加明顯的療效[13]。最近有人將IFNα與PlGF-2123-144肽段進(jìn)行融合，獲得了抗癌活性高的IFNα[15]。

因此將PlGF-2123-144肽段用于改造抗纖維化藥物可賦予它們與I型膠原蛋白的高親和性,可以提高藥物對(duì)纖維化組織的靶向、增加藥物的有效治療濃度,還有助于藥物的緩釋。本研究所獲得的蛋白擁有較好的產(chǎn)量和純度，并很好地維持了同I型膠原蛋白結(jié)合的高親性，為進(jìn)一步研究PlGF-2123-144對(duì)抗纖維化藥物改性，尋找更有效、副作用更小的抗纖維化藥物奠定了基礎(chǔ)。