史艷彬，馬超，余巧巧，邵小光

(大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖與遺傳醫(yī)學(xué)中心，大連 116000)

受精卵含有三個(gè)原核稱為3PN(tripronuclear)合子。3PN在體外受精(IVF)胚胎中的發(fā)生率是4%～7%，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)胚胎中的發(fā)生率是6%[1]。IVF過(guò)程中的3PN胚胎中，80%以上是因?yàn)殡p精入卵導(dǎo)致；而ICSI過(guò)程中的3PN胚胎主要是卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂失敗或第二極體未能排出導(dǎo)致[2]。

以往關(guān)于3PN的研究主要集中在染色體[3]，而不是細(xì)胞周期的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。研究發(fā)現(xiàn)，在80%以上的IVF 3PN胚胎中可以觀察到兩對(duì)中心粒，而ICSI 3PN胚胎中僅發(fā)現(xiàn)一對(duì)中心粒[4]。因?yàn)榈谝淮斡薪z分裂被父源性中心?？刂疲覀兺茰y(cè)IVF 3PN與ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式可能存在差別。3PN胚胎的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與2PN胚胎相同，所以IVF周期中原核過(guò)早消失的胚胎因無(wú)法明確PN數(shù)往往被丟棄。本文通過(guò)時(shí)差胚胎監(jiān)測(cè)(Time-lapse)培養(yǎng)箱，比較IVF 3PN與ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式和胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為避免錯(cuò)誤地丟棄具有發(fā)育潛能的胚胎提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年7月至2018年6月就診于大連市婦女兒童醫(yī)療中心的生殖與遺傳醫(yī)學(xué)中心接受輔助生殖技術(shù)(ART)助孕并同意將胚胎放置Time-lapse培養(yǎng)箱中培養(yǎng)監(jiān)測(cè)的患者142例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：2PN組胚胎來(lái)源于受精卵全部是2PN(本周期沒(méi)有3PN、1PN、0PN)的患者，3PN組胚胎來(lái)源于受精卵至少有一個(gè)3PN的患者；年齡≤38周歲；ART次數(shù)<3次。排除標(biāo)準(zhǔn)：卵巢功能儲(chǔ)備下降；FSH>20 U/L；子宮內(nèi)膜異位癥；PCOS患者；男方嚴(yán)重少弱畸精子癥；補(bǔ)救顯微受精患者。排除未分裂合子、5細(xì)胞以下和碎片>20%的胚胎。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)受精方式及受精結(jié)果分為4組：IVF 2PN組(n=150)、ICSI 2PN組(n=100)、IVF 3PN組(n=132)、ICSI 3PN組(n=11)。

2.IVF和胚胎培養(yǎng)：常規(guī)超促排卵、陰道經(jīng)B超引導(dǎo)下采卵、獲得的卵冠丘復(fù)合物在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～6 h后，依據(jù)治療指征給予IVF或ICSI受精。ICSI受精后立即放置Time-lapse三氣培養(yǎng)箱中(ESCO Miri-TL，丹麥)連續(xù)培養(yǎng)；IVF精卵共培養(yǎng)置于三氣培養(yǎng)箱中(Labotect C200，德國(guó))，短時(shí)受精推測(cè)受精后放置Time-lapse三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。所有胚胎使用一步培養(yǎng)液(global total LP，美國(guó))培養(yǎng)，2PN胚胎培養(yǎng)至D3天移植或冷凍，3PN胚胎培養(yǎng)至八細(xì)胞以上。

3.Time-lapse監(jiān)測(cè)和評(píng)估：平均每10 min圖像被記錄一次。對(duì)于ICSI胚胎，精子注入卵母細(xì)胞的時(shí)間定義為t0；對(duì)于IVF胚胎，卵母細(xì)胞加入調(diào)好濃度的精液盤中的時(shí)間定義為t0。所有關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)和分裂模式在Time-lapse軟件系統(tǒng)下被同一觀察者定義。記錄卵裂模式、原核出現(xiàn)的時(shí)間、原核消失的時(shí)間、第一次卵裂的時(shí)間、t4(從1-細(xì)胞分裂成4-細(xì)胞的時(shí)間)、t3-t5(從3-細(xì)胞分裂成5-細(xì)胞的時(shí)間)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、各組胚胎卵裂模式比較

IVF 3PN胚胎組79.55%(105/132)直接分裂成4-細(xì)胞，18.94%(25/132)直接分裂成3-細(xì)胞，0.76%(1/132)直接分裂成5-細(xì)胞，0.77%(1/132)直接分裂成6-細(xì)胞；IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎組異常分裂模式主要為直接分裂成3-細(xì)胞。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：IVF 3PN胚胎分裂成2-細(xì)胞比率顯著低于其余3組(P<0.001)，IVF 3PN胚胎直接分裂成4-細(xì)胞的比例顯著高于其余3組(P<0.001)；而IVF 3PN和IVF 2PN胚胎、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎直接分裂成3-細(xì)胞比率無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂異常比率比較

IVF 3PN胚胎第一次卵裂模式異常率、在28 h發(fā)育到4-細(xì)胞的比率以及t3-t5<11 h的胚胎比率均顯著高于其余3組(P<0.001)；而IVF 3PN胚胎在23 h發(fā)生第一次卵裂的比率顯著低于其余3組(P<0.001)(表2)。

三、各組胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

IVF 3PN胚胎原核消失的時(shí)間、第一次卵裂時(shí)間均顯著長(zhǎng)于其余3組(P<0.05)； IVF 3PN胚胎分裂成4-細(xì)胞的時(shí)間(t4)及從3-細(xì)胞到5-細(xì)胞(t3-t5)的時(shí)間均顯著短于其余3組(P<0.05)；IVF 2PN、ICSI 3PN和ICSI 2PN之間的卵裂動(dòng)力參數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1 IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂模式比較[n(%)]

注：與IVF 3PN組比較，*P<0.001

表2 IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂異常率比較[n(%)]

注：與IVF 3PN組比較，*P<0.001

表3 各組胚胎的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(-±s)

注：與IVF 3PN組比較，*P<0.05

討論

部分研究者通過(guò)第2天觀察IVF 3PN合子有絲分裂的過(guò)程發(fā)現(xiàn)了部分合子直接分裂成3-細(xì)胞的現(xiàn)象。Kola等[5]報(bào)道了29個(gè)IVF 3PN合子中，18個(gè)(62%)直接分裂成3-細(xì)胞；Balakier[6]報(bào)道了32個(gè)IVF 3PN合子中，6個(gè)(19%)直接分裂成3-細(xì)胞；Pang等[7]報(bào)道了32個(gè)IVF 3PN合子中，7個(gè)(22%)直接分裂成3-細(xì)胞。然而，這些報(bào)道都是傳統(tǒng)的非連續(xù)性的胚胎評(píng)估。Staessen等[8]報(bào)道了ICSI 3PN合子有絲分裂的過(guò)程發(fā)現(xiàn)：第2天胚胎處于2-細(xì)胞或4-細(xì)胞階段，研究還比較了IVF和ICSI 3PN在第2天的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)二者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與既往研究的胚胎培養(yǎng)方式不同，我們使用Time-lapse培養(yǎng)箱發(fā)現(xiàn)IVF 3PN中的79.55%(105/132)直接分裂成4-細(xì)胞，18.94%(25/132)直接分裂成3-細(xì)胞，0.76%(1/132)直接分裂成5-細(xì)胞，0.76%(1/132)直接分裂成6-細(xì)胞。我們也觀察到IVF 3PN分裂成3-細(xì)胞比率略高于ICSI 3PN，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(18.94% vs.18.18%，P=0.95)。

中心粒和其周圍的基質(zhì)組成了有絲分裂的紡錘體。1994年，Palermo等[9]研究證明精子的中心粒控制著合子的第1次有絲分裂。二精入卵可能會(huì)在合子中形成兩對(duì)中心粒，如果合子中過(guò)度的中心粒不休眠，那么過(guò)度的中心粒就有可能使合子卵裂異常：直接分裂成3-細(xì)胞[10]。因此，我們推測(cè)這就是IVF 3PN直接卵裂成3-細(xì)胞以上的發(fā)生率要顯著高于IVF 2PN、ICSI 2PN和ICSI 3PN的原因。但是在Time-lapse下不能直接觀察到中心粒和紡錘體結(jié)構(gòu)，因此不能得到最終的結(jié)論。

然而，多余的父源性中心粒影響卵裂的假說(shuō)卻不能解釋部分正常2PN和部分ICSI 3PN也可能直接卵裂成3-細(xì)胞。 推測(cè)可能是卵孤雌激活會(huì)形成一個(gè)沒(méi)有中心粒的紡錘體極，再與一個(gè)正常的中心粒結(jié)合就可能形成第3個(gè)紡錘體[11]；也有可能是父源性中心粒在第1個(gè)細(xì)胞周期的S期發(fā)生加倍復(fù)制，或者精子中攜帶兩對(duì)中心粒[12-13]。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)2PN胚胎直接卵裂成3-細(xì)胞的植入率顯著低于正常卵裂模式的胚胎[14]。第3個(gè)紡錘體極形成的原因以及如何形成的將有待于進(jìn)一步研究。

我們還發(fā)現(xiàn)IVF 3PN第1個(gè)細(xì)胞周期顯著長(zhǎng)于IVF 2PN[(27.06±1.59)h vs.(22.64±1.38)h](P=0.04)。推測(cè)可能是相比2PN胚胎，3PN胚胎的有絲分裂紡錘體結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。因?yàn)榧忓N體的三級(jí)結(jié)構(gòu)，有絲分裂的微管可能在3個(gè)位點(diǎn)連接在著絲粒，從而形成異常的“Y”字形赤道板，使得3PN胚胎需要更長(zhǎng)的時(shí)間發(fā)生卵裂。本研究中，盡管ICSI 3PN直接分裂成3-細(xì)胞的比例高于ICSI 2PN(18.18% vs.11.00%，P=0.09)，但是ICSI 3PN第1次卵裂的時(shí)間與ICSI 2PN相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(22.32±1.56)h vs.(22.78±1.66)h](P=0.82)。雖然我們的研究數(shù)量有限，但是可以推測(cè)IVF 3PN與ICSI 3PN異常卵裂的原因不同。ICSI 3PN直接卵裂成3-細(xì)胞可能是合子先直接分裂成2-細(xì)胞，其中1個(gè)卵裂球沒(méi)有發(fā)生DNA和中心粒的復(fù)制就迅速發(fā)生分裂，并沒(méi)有形成耗時(shí)的“Y”字形赤道板。

受顯微鏡技術(shù)發(fā)展的限制，3PN胚胎的發(fā)生機(jī)制還不清楚：是由于皮質(zhì)反應(yīng)缺陷導(dǎo)致雙精入卵，還是卵源性/精源性減數(shù)分裂錯(cuò)誤導(dǎo)致雙雌受精/雙雄受精?國(guó)外學(xué)者新開(kāi)發(fā)的顯微鏡技術(shù)——激光層片掃描顯微技術(shù)(Light sheet Microscopy technology，LSMT)[15]，依賴其高速和空間精度大大減少了胚胎接觸的光毒性和光漂白性，并且具有非常高的時(shí)間分辨率的特性能夠?qū)ε咛グl(fā)育早期階段進(jìn)行實(shí)時(shí)、3D成像。期待應(yīng)用該技術(shù)可以早日揭示3PN胚胎的發(fā)生和異常卵裂的機(jī)制。