許劍鋒，王曉尉#，張林媛，傅龍龍，梁小薇*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所男性臨床研究室，北京 100081；2.中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所毒理室，北京 100050)

能量代謝是支撐精子功能的關(guān)鍵因素，在受精過程中，精子的運(yùn)動(dòng)、獲能、超活化和頂體反應(yīng)都是高度依賴能量，所以能量代謝在正常男性配子功能中起著極其重要的作用。三磷酸腺苷(ATP)主要由氧化磷酸化與糖酵解兩種途徑產(chǎn)生，是精子運(yùn)動(dòng)和發(fā)揮功能的主要能量來源。目前研究認(rèn)為：人類精子的能量供應(yīng)同時(shí)需要氧化磷酸化與糖酵解這兩種途徑，前者發(fā)生在線粒體，后者發(fā)生在精子頭部和鞭毛主段[1]。無論哪一種途徑受到抑制或損害，都將影響精子的活力和功能。為此，本研究采用線粒體氧化磷酸化特異性抑制劑羰基氰-對-三氟甲氧基苯腙(carbonylcyanidep-trifluoromethoxyphenyl-hydrazone，F(xiàn)CCP)處理人精子，通過檢測精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、線粒體膜電位和ATP含量等的變化，探討線粒體氧化磷酸化在精子能量代謝中的作用。

資料與方法

一、研究對象

1.精液樣本來源：本研究的精液標(biāo)本來自國家衛(wèi)健委科學(xué)技術(shù)研究所人類精子庫的捐精志愿者。本研究經(jīng)該所生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，捐精志愿者均簽署知情同意書。精液的收集和納入標(biāo)準(zhǔn)參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊 》第5版[2](以下簡稱《第五版手冊》)方法，精液體積2～5 ml，精子濃度≥40×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)≥32%，精子活動(dòng)率≥40%，精子正常形態(tài)率≥4%，pH 7.2～7.5。

2.主要試劑：精子BWW培養(yǎng)基、Percoll梯度分離液、Hepes緩沖液、伊紅染液均為北京索萊寶產(chǎn)品；伊紅-苯胺黑染液為深圳華康產(chǎn)品；FCCP(C2920，Sigma，美國)。

3.主要儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)(Thermo，德國)、恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，德國)、Makler精子計(jì)數(shù)板(Sefi-Medical Instruments，以色列)、酶標(biāo)儀(Tecan Infinite M200，瑞士)、計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀(Hamilton Thorne-IVOS CASA，Beverly，美國)、流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6，美國)、熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

二、研究方法

1.精液收集和預(yù)處理：捐精志愿者年齡22～40歲，禁欲5～7 d，以手淫法獲取一次射精的全部精液，放入無菌帶蓋塑料杯內(nèi)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中30～60 min，使之完全液化。用Makler精子計(jì)數(shù)板在顯微鏡下初檢精子濃度和活動(dòng)率，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的精液參照《第5版手冊》采用非連續(xù)梯度密度離心法[2]處理。優(yōu)選后的高質(zhì)量精子用含20 mmol/L Hepes的BWW培養(yǎng)基洗滌兩次(300g，10 min)并調(diào)整精子懸液濃度為20×106/ml待用。

2.FCCP共孵育：吸取少量DMSO溶解FCCP，用BWW稀釋至實(shí)驗(yàn)終濃度為0 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，DMSO的含量保持低于0.1%。

符合標(biāo)準(zhǔn)的精液標(biāo)本共8份，預(yù)處理后的精子懸液各分成4組，每組分別以等體積與不同濃度的FCCP在37℃共孵育1 h、3 h、5 h。

3.精子動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測：調(diào)整精子懸液濃度為20×106/ml。FCCP處理1、3、5 h后，從每份精子懸液中取出10 μl以計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)評價(jià)每份樣本至少200個(gè)精子的運(yùn)動(dòng)能力。記錄活動(dòng)率(%)、前向運(yùn)動(dòng)百分率(%)、平均路徑速率(VAP)、直線速率(VSL)、曲線速率(VCL)、前向性(STR,為平均路徑的直線性。STR=VSL/VAP)、直線性(LIN,為曲線路徑的直線性。LIN=VSL/VCL)、精子頭部側(cè)向運(yùn)動(dòng)平均振幅(ALH)和鞭打頻率(BCF)。

4.線粒體功能檢測：(1)線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP)：調(diào)整精子懸液濃度為1×106/ml，受試物處理5 h后，按照J(rèn)C-10線粒體膜電位檢測試劑盒(AAT Bioquest，美國)說明書操作；采用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)L1通道收集綠色熒光信號(hào)，F(xiàn)L2通道收集紅色熒光信號(hào)，記錄FL2/FL1比值。(2)精子細(xì)胞內(nèi)ATP 含量：采用EZScreenTMATP Colorimetric Assay Kit(Biovision，美國)試劑盒檢測，按照試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀(Tecan Infinite M200，瑞士)上檢測光密度。ATP含量以pM/百萬個(gè)精子表示。

5.質(zhì)膜完整性(plasma membrane integrity，PMI)檢測：精子懸液與不同濃度的FCCP共孵育5 h后，參照《第5版手冊》中方法伊紅-苯胺黑染色分析統(tǒng)計(jì)精子質(zhì)膜完整率。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果

一、FCCP對精子運(yùn)動(dòng)的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，F(xiàn)CCP處理精子1 h后，10 μmol/L組的活動(dòng)率[(36.00±2.65)% vs.(55.20±10.16)%]和前向運(yùn)動(dòng)百分率[(19.67±1.53)% vs.(40.00±14.51)%]均顯著低于對照組(P<0.05)，5 μmol/L和10 μmol/L組的ALH有顯著降低(P<0.05)，其他運(yùn)動(dòng)參數(shù)未見顯著變化(P>0.05)(表1)。

表1 不同濃度FCCP處理精子1 h后精子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(-±s)

注：與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05

FCCP處理精子3 h后，10 μmol/L組的活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)百分率、VAP、VSL、VCL、ALH和BCF與對照組的相應(yīng)指標(biāo)比較均顯著下降(P<0.05)，5 μmol/L組的ALH和BCF也顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

不同濃度的FCCP處理精子5 h后，各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)仍呈隨著處理濃度增加而下降的趨勢，10 μmol/L組與對照組相比，活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)百分比、VSL、VCL、ALH和BCF顯著低于對照組(P<0.05)，VAP也降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；5 μmol/L組的活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)百分比和BCF顯著低于對照組(P<0.05)；2.5 μmol/L組前向運(yùn)動(dòng)百分率也顯著低于對照組(P<0.05)(表3)。

二、FCCP對精子線粒體功能及質(zhì)膜完整性的影響

根據(jù)上述結(jié)果，F(xiàn)CCP處理精子1、3、5 h均對精子活力產(chǎn)生了影響，特別是5 h，隨著時(shí)間延長，精子活力下降明顯。故選擇5 h作為觀察終點(diǎn)，進(jìn)行MMP、ATP及質(zhì)膜完整性(PMI)的檢測。結(jié)果顯示，5 μmol/L和10 μmol/L FCCP處理精子5 h后，均顯著降低MMP和ATP(P<0.05)，并隨著濃度增加有逐漸降低趨勢；10 μmol/L組的PMI為(73.94±7.11)%，顯著低于對照組(84.53±11.65)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他濃度組的PMI盡管低于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表2 不同濃度FCCP處理精子3 h后精子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(-±s)

注：與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 不同濃度FCCP處理精子5 h后精子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(-±s)

注：與對照組(0 μmol/L)相比，*P<0.05，#P<0.01

表4 不同濃度FCCP處理精子5 h后對精子質(zhì)膜完整性和線粒體功能的變化

注：與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05，#P<0.01

討論

精子是高度分化的細(xì)胞，能夠適應(yīng)不同的環(huán)境條件，ATP為精子執(zhí)行核心功能提供了能量。如果精子受到外源性物質(zhì)的刺激，可能導(dǎo)致質(zhì)膜和動(dòng)力學(xué)的改變，使能量代謝變化，進(jìn)而影響其與卵母細(xì)胞結(jié)合以及受精的能力[3]。有研究表明，精子ATP的產(chǎn)生可以通過兩種途徑即糖酵解和氧化磷酸化。從理論上講，通過氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP是糖酵解的15倍[1]。但是關(guān)于人的精子更多的利用氧化磷酸化還是糖酵解的能量代謝方式以維持精子運(yùn)動(dòng)尚有爭論。因此，本研究利用氧化磷酸化的抑制劑，觀察精子的氧化磷酸化途徑受到抑制而糖酵解正常狀態(tài)下精子運(yùn)動(dòng)和線粒體功能的影響。

已知羰基氰-對-三氟甲氧基苯腙(FCCP)是經(jīng)典的氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。早在1990年有研究者描述了FCCP在線粒體內(nèi)膜水平的作用機(jī)制[4]。FCCP是親脂性弱酸，可以輕易地?cái)U(kuò)散穿過線粒體內(nèi)膜，進(jìn)入呈酸性的線粒體膜間部位，以不帶電(質(zhì)子化)形式將膜間隙的H+帶回線粒體并釋放到基質(zhì)中，從而消除了線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的H+濃度梯度，使ATP合成酶喪失被激活的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，不能合成ATP，因此解除了氧化與磷酸化的偶聯(lián)，抑制氧化磷酸化[5]。Davila等[6]采用線粒體解偶聯(lián)劑CCCP處理種馬精子，發(fā)現(xiàn)種馬精子的線粒體膜電位下降，ATP產(chǎn)量下降，精子活動(dòng)率下降。該研究也采用了糖酵解的抑制劑，也出現(xiàn)相似的結(jié)果，但各項(xiàng)指標(biāo)降低程度是不同的，證實(shí)兩種供能途徑都是需要的，但以氧化磷酸化為主[6]。Ramió-Lluch等[7]研究表明線粒體活性解偶聯(lián)能降低公豬精子活力，表明線粒體ATP的產(chǎn)生是至關(guān)重要的。本研究采用體外試驗(yàn)常用的FCCP濃度2～10 μmol/L[7]處理人精子，結(jié)果表明精子與FCCP共孵育1 h，運(yùn)動(dòng)速率沒有顯著變化，而隨著FCCP處理時(shí)間延長，精子的活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)百分率和運(yùn)動(dòng)速率都呈下降趨勢，特別是平均路徑速率(VAP)、直線速率(VSL)、曲線速率(VCL)降低明顯；并且，隨著FCCP的濃度增加，各項(xiàng)指標(biāo)均呈濃度依賴的下降，提示較高濃度的FCCP可能更大程度上打破了線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的濃度梯度，ATP的合成受到較大影響，而使精子的供能不足從而影響了精子運(yùn)動(dòng)。盡管糖酵解可能仍在發(fā)揮功能作用，但也未能抵消氧化磷酸化受到抑制后對精子運(yùn)動(dòng)的影響。在3個(gè)處理濃度中5 μmol/L和10 μmol/L均能很好地抑制精子運(yùn)動(dòng)，而濃度較低的2.5 μmol/L組的各項(xiàng)指標(biāo)在不同孵育時(shí)間下變化均不明顯。在體外試驗(yàn)中若采用FCCP作為陽性對照組，可以考慮適當(dāng)提高處理濃度和孵育時(shí)間。

精子線粒體是反應(yīng)精子健康狀態(tài)和生育的標(biāo)志物[8-9]，在能量生成中線粒體具有核心的作用。線粒體具有兩側(cè)膜結(jié)構(gòu)-外膜和內(nèi)膜。線粒體內(nèi)膜(IMM)是通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的部位，控制著離子和代謝產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白傳輸，以及細(xì)胞的氧化狀態(tài)[10]。IMM的完整和非滲透性保證了線粒體功能的正常。線粒體膜電位反應(yīng)了沿著電子傳遞鏈電子傳遞而形成的質(zhì)子梯度，而這個(gè)梯度被ATP合成酶利用產(chǎn)生ATP[11]。外源性物質(zhì)作用于線粒體的靶部位之一是線粒體內(nèi)膜[11]。本研究引入氧化磷酸化抑制劑FCCP，發(fā)現(xiàn)5 μmol/L和10 μmol/L FCCP處理精子5 h使線粒體膜電位和ATP含量均比對照組顯著降低，可能的機(jī)制為IMM對質(zhì)子的滲透性增加，跨膜質(zhì)子梯度破壞，導(dǎo)致跨膜電位崩潰，損害ATP合成的驅(qū)動(dòng)力，使得精子能量供應(yīng)受損[11-12]。表明氧化磷酸化對精子活動(dòng)的能量供應(yīng)有重要作用。

有研究推測氧化磷酸化通路主要在人類精子運(yùn)動(dòng)前期起主導(dǎo)作用，后期精子主要利用糖酵解進(jìn)行供能，其目的是為了減少氧化損傷從而來維持長時(shí)間快速前向運(yùn)動(dòng)；糖酵解和線粒體的氧化呼吸都參與ATP的合成，它們互相依賴，從而使精子在應(yīng)對體外不同能量代謝底物刺激時(shí)能靈活轉(zhuǎn)變，從而提供充足的能量以維持精子活動(dòng)力和功能[13-14]。也有研究認(rèn)為精子能量供應(yīng)方式有物種差異，如牛精子線粒體氧化磷酸化或糖酵解均較強(qiáng)，而人類和大鼠、小鼠主要依賴糖酵解供能[15-16]。本研究采用了氧化磷酸化抑制劑FCCP與人精子共孵育，檢測了精子動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和線粒體功能標(biāo)志物，結(jié)果表明FCCP通過對氧化磷酸化的解偶聯(lián)作用使精子運(yùn)動(dòng)能力和線粒體活性明顯降低，并且這種能量供應(yīng)的不足是糖酵解所不能完全代償?shù)?，所以氧化磷酸化是維持人類精子功能的重要能量代謝途徑。