高勝男 李言君 李建衛(wèi) 崔彩云 李煥煥 王雯虹

口腔扁平苔蘚（oral lichen plauns，OLP）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性黏膜疾病，發(fā)病率在一般人群中約為0.1%～4%，OLP的臨床表現(xiàn)從無癥狀的白色網(wǎng)狀病損到有癥狀的萎縮性糜爛型紅色病損，呈多樣化表現(xiàn)。糜爛型OLP是OLP中最嚴重的病損類型，患者具有明顯的臨床癥狀，且有癌變潛能。本研究采用miRNAs芯片篩選糜爛型OLP病損黏膜相比正常黏膜差異表達的miRNAs，有助于闡明糜爛型OLP發(fā)病分子機制及尋找特異性治療靶點，對具有癌變傾向OLP的診斷及治療具有重要的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

RNAlater?（賽默飛世爾科技，美國）；Trizol?試劑（Invitrogen life technologies公司，美國）；Biopulverizer冷凍組織粉碎缽、勻漿器（Mini-Bead-Beater-16）（Biospec公司，美國）；-80℃超低溫冰箱、HVE-50高壓蒸汽消毒鍋（Sanyo公司，日本）；NanoDrop ND-1000超微量分光光度計、Baseline-ZERO DNase（EPICENTER公司，美國）；RNasey Mini Kit、miRNA Complete Labeling and Hyb Kit、雜交室，雜交室密封墊片基、雜交烤箱、安捷倫微陣列雜交室用雜交烤箱旋轉(zhuǎn)器、Gene Expression Wash Buffer Kit、安捷倫微陣列掃描儀（安捷倫科技公司，美國）；磁力攪拌棒、磁力攪拌板（康寧公司，美國）；帶載玻片架的滑動染色皿（Thermo Shandon p/n 121，美國）。

1.2 實驗對象和分組

收集濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔黏膜科糜爛型OLP病損部位黏膜組織患者3例，活檢切取局部黏膜5 mm×5 mm，分為2份，一份送常規(guī)組織病理學診斷，一份留存于-80℃冰箱備用。待OLP病損組織經(jīng)組織病理學診斷確診后納入實驗。同時，采集口腔頜面外科正?？谇火つそM織3例，阻生齒拔除術中切下的多余牙齦組織。組織經(jīng)RANlater?浸泡并在4℃條件下孵育過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冰凍保存。實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會均簽署知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取和質(zhì)量控制 使用Biopulverizer將冷凍組織粉碎，Mini-Bead-Beater-16勻漿后，加入TRIzol?試劑，按其說明書提取組織樣本總RNA。RNasey Mini試劑盒純化miRNA和總RNA，通過NanoDrop ND-1000測定RNA在230、260、280 nm的吸收值。以評估RNA是否降解并測定RNA濃度。RNA完整性需通過甲醛變性凝膠電泳進行評估。并取得RNAQC報告。純RNA的A260/A280比率應該接近2.0（1.8和2.1之間的比率是可接受的），A260/A230的比例應該大于1.8。

1.3.2 RNA標記和雜交 來自每個組織樣本的miRNA在T4 RNA ligase作用下用Cyanine 3-pCp標記，標記產(chǎn)物濃縮干燥后用水重溶，標準條件下標記好的探針在Agilent微陣列上雜交。將干燥的樣品重懸于無核酸酶水中，配制雜交液加入，100℃溫育5 min，然后立即轉(zhuǎn)移到冰浴中5 min，將雜交體系置于55℃的雜交爐中，將雜交旋轉(zhuǎn)器設置為以20 r/min的速度旋轉(zhuǎn)，在55℃下雜交20 h。用基因表達洗滌緩沖液試劑盒（Agilent p/n 5188-5327）洗滌雜交芯片以備掃描。實驗過程按照標記和雜交試劑盒的說明書完成。

1.3.3 芯片掃描 Agilent微陣列掃描儀（Agilent p/n G2505C）掃描雜交芯片后，使用Agilent Feature Extraction軟件采集芯片探針信號值。使用GeneSpring GX v 12.1軟件（Agilent Technologies）進行芯片標準化。

1.3.4 生物信息學分析 應用以下miRNA生物信息庫對miRNA目標預測：TargetScan（http：//www.targetscan.org），miRPathDBv1.1（https：//mpd.bioinf.unisb.de/），DIANAMicroT（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php），miRDB（http：//mirdb.org/）。選取至少3個軟件預測到的靶基因作為今后實驗將驗證的目標靶基因。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用Agilent Feature Extraction軟件（v 11.0.1.1）獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。采用百分位平移法對所有數(shù)據(jù)進行歸一化并對數(shù)轉(zhuǎn)化，相比正常黏膜組織，糜爛型OLP黏膜組織中差異表達的miRNAs，根據(jù)Benjamini Hochberg FDR方法得到修正的P值（即FDR）進行篩選，默認Fold Change≥2.0，F(xiàn)DR≤0.05。與P值篩選相比，該方法能夠降低假陽性率。使用R腳本進行層次聚類。

2 結(jié) 果

2.1 實驗組織樣本總RNA抽提結(jié)果

A260/A280比率均在1.8～2.0之間，A260/A230的比例均大于1.8（表1）。電泳實驗結(jié)果：28S和18S核糖體RNA帶明亮、清晰，條帶銳利，上頻條帶強度約為下頻條帶的2倍，說明樣本組織RNA沒有降解，已提取高純度RNA（圖1）。證明可以進行下一步實驗。

表1 實驗組織樣本總RNA的質(zhì)檢和定量Tab 1 Quality inspection and quantification of total RNA in experimental tissue samples

2.2 miRNA芯片結(jié)果

芯片原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理后，在一個二維直角坐標系平面中，繪制散點圖，可清晰、明顯的反應樣本間的變化，所有數(shù)據(jù)采用同一標準。X軸：該點在對照樣本芯片中標準化后的信號值。Y軸：該點在實驗樣品芯片中標準化后的信號值。從由熒光信號值構成的散點圖來看，整個圖呈現(xiàn)較為集中的趨勢，絕大多數(shù)無差異表達信號值位于45°角平分線附近，差異表達信號值則發(fā)生偏離（圖2）。證明原始數(shù)據(jù)的標準化是正常的。

圖1 6例實驗組織樣本提取的總RNA甲醛變性凝膠電泳圖Fig 1 Standard denaturing gel electropherogram of the total RNA extracted from 6 experimental tissue samples

圖2 實驗樣本熒光信號值散點分布圖Fig 2 The scatter plot of the fluorescence signal values

根據(jù)Benjamini Hochberg FDR方法得到修正的P值（即FDR）進行差異miRNA篩選，默認Fold Change＞2.0，F(xiàn)DR＜0.05。篩選出159個差異表達的miRNAs（上調(diào)＞2倍或下調(diào)＜2倍），表達上調(diào)的有12個，表達下調(diào)的有147個（圖3）。用差異表達的159個miRNAs對所有標本的系統(tǒng)聚類分析（圖4），其中差異表達＞4倍的有18個，其中表達上調(diào)的有6個，表達下調(diào)的有12個（表2）。

2.3 靶基因預測結(jié)果

篩選出miR-206、miR-133b為在糜爛型OLP的研究中作為感興趣的miRNA，利用miRNA生物信息庫TargetScan、miRPathDBv1.1、，DIANAMicroT、miRDB對其進行靶基因的預測。選擇至少3個軟件預測到的靶基因，以減小假陽性率。miR-206篩選出39個預測靶基因，通過查閱相關文獻最終篩選出5個與糜爛型OLP相關的預測靶基因，miR-133b最終篩選出1個預測靶基因（表3）。

圖3 糜爛型OLP黏膜組織和正常黏膜組織差異表達的miRNAsFig 3 Differentially expressed miRNAs in erosive OLPmucosa and normal mucosa

圖4 糜爛型OLP和正常組織黏膜中差異表達的159種miRNAsFig 4 159 miRNAs differentially expressed in erosive OLP and normal tissue mucosa

3 討 論

MicroRNAs（miRNAs）是一種內(nèi)源性不編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，通過與靶信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（UTR）進行不完全的堿基配對，減少目標mRNA的翻譯和/或誘導其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后抑制蛋白質(zhì)的表達［1］。研究證明miRNAs是調(diào)控細胞周期、細胞死亡、分化和免疫的不可缺少的分子。近來有學者開始探討研究miRNA與OLP相關關系［2］，已有研究證明相關miRNA可以通過其靶基因參與OLP發(fā)病及進展甚至惡變的過程或相關miRNA調(diào)節(jié)通路中的某種物質(zhì)可能通過與淋巴細胞的相互作用，共同介導OLP的免疫調(diào)節(jié)［3-4］。但是針對于miRNA與糜爛型OLP相關性的研究較少。探討其相關miRNA有助于闡明糜爛型OLP的分子發(fā)病機制，對具有癌變傾向OLP的診斷及治療具有重要的理論意義和應用價值。

表2 糜爛型OLP中18個差異表達4倍以上的miRNAsTab 2 18 miRNAs with more than 4 times differential expression in erosive OLP

表3 miR-206和miRv133b分別相關的靶基因Tab 3 miR-206 and miR-133b respectively related target genes

本研究中采用靶向人類2 549個miRNAs的基因芯片，篩選出159個差異表達2倍以上的miRNAs，其中12個表達上調(diào)，147個表達下調(diào)。本研究結(jié)果中出現(xiàn)了miR-206、miR-133b的高表達，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-206、miR-133b通過其靶基因調(diào)控，參與乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等多種癌性疾病的發(fā)生及進展［5-8］，且其中STC2［9］、ANXA2［10］、TAGLN2［11］等多個靶基因與口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的發(fā)生相關。本研究提示miR-206和miR-133b可能在糜爛型OLP的發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用，其具體調(diào)控機制仍需進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)在糜爛型OLP和正常黏膜組織中差異表達＞4倍的miRNAs共18個，其中miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b、miR-206的差異＞30倍，這些明顯差異表達的miRNAs的在糜爛型OLP發(fā)生中的作用機制尚不清楚，本實驗采用4個miRNA生物信息庫對miR-206和miR-133b進行靶基因預測，其中有很多涉及細胞周期調(diào)控、增殖、信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡的靶基因，有研究發(fā)現(xiàn)靶基因KIF2A在口腔鱗狀舌癌中過表達［12］；FNDC3B基因可在缺氧微環(huán)境中促進舌鱗狀細胞癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［13］；BACH2介導TNF-α誘導的牙齦上皮細胞凋亡［14］。但具體調(diào)控機制尚未見報道。對這些差異表達的miRNA及其靶基因的深入研究，有助于進一步了解糜爛型OLP發(fā)病的分子生物學機制，并從中尋找可能的早期診斷分子生物學標志和基因治療的新靶點。

目前對于糜爛型OLP中特異miRNA表達譜的研究尚沒有一致的結(jié)論，今后的研究應擴大樣本量，驗證基因芯片篩選出的有明顯差異表達的miRNAs在糜爛型OLP中的表達，其靶基因和信號通路在糜爛型OLP中的具體調(diào)控途徑將是本研究下一步重點。