呂廣應(yīng) 劉乙臻 張秀梅 王琳源

慢性根尖周炎是外界物理、化學(xué)和生物性損傷刺激根尖周組織而引起的慢性炎癥反應(yīng)，不僅損傷根尖周組織，還與心血管疾病、糖尿病等系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。目前臨床上治療慢性根尖周炎主要是采用根管治療，但有部分根尖周炎的患者在經(jīng)過治療后根尖周組織仍存在炎癥，無法從根本上治療根尖周炎［1-2］。因此，研究慢性根尖炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，尋找關(guān)鍵的阻斷靶點(diǎn)是目前亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)宿主對(duì)抗根尖周致病菌的免疫應(yīng)答在慢性根尖周炎的發(fā)病過程中具有重要作用［3］，其中調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞越來越受到人們的關(guān)注［4］。Treg細(xì)胞特異性地表達(dá)叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄分子（forhead box P3，F(xiàn)oxp3）和表面分子CD25、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor，GITR），分泌抑炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），在慢性牙周炎、口腔扁平苔蘚病損、慢性胃炎等感染性疾病以及多發(fā)性肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中削弱炎癥效應(yīng)，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定［5-9］。研究發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎牙周組織破壞期，牙齦組織中Treg細(xì)胞數(shù)量減少，相關(guān)細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β）表達(dá)降低，而在牙周組織修復(fù)期，Treg細(xì)胞數(shù)量增多，相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)增高［10］。Gar-let等［11］采用抗體阻斷的方法阻斷Treg細(xì)胞表面分子GITR，抑制Treg細(xì)胞的功能，加重了伴放線放線桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans，Aa）誘導(dǎo)的牙周組織炎癥程度和牙槽骨吸收。與慢性牙周炎相似，慢性根尖周炎作為一種細(xì)菌感染性疾病，以炎癥和牙槽骨破壞為主要特征。然而在慢性根尖周炎的病損組織中Treg細(xì)胞表現(xiàn)如何，在其發(fā)病過程中可能發(fā)揮怎樣的作用，目前在國(guó)內(nèi)有關(guān)這方面的報(bào)道較少。本研究旨在通過檢測(cè)Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在慢性根尖周炎病損組織中的表達(dá)情況，探討Treg細(xì)胞在慢性根尖周炎的作用，為慢性根尖周炎的免疫學(xué)研究提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

Marker（賽默飛公司，美國(guó)）；Foxp3抗體、IL-10抗體（Cell Signaling公司，美國(guó)）；β-actin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；羊抗兔二抗（EarthOx，LLC公司，美國(guó)）；PVDF膜（GE公司，美國(guó)）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京Vazyme公司）；Trizol（Ambion公司，美國(guó)）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒、Foxp3引物合成、IL-10引物合成、DEPC水（北京鼎國(guó)昌盛公司）。

1.2 樣本采集和處理

收集2016-12～2017-05錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科門診15例依據(jù)臨床表現(xiàn)和X線片所見診斷為慢性根尖周炎，需要進(jìn)行根尖外科手術(shù)或拔除的患牙，取與牙根尖周區(qū)相連的病損軟組織作為實(shí)驗(yàn)組。收集15例埋伏阻生需要拔除的患牙，取阻生牙冠方覆蓋的健康牙齦組織作為對(duì)照組［12-14］。慢性根尖周炎納入標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)證實(shí)有根尖周骨質(zhì)破壞；根尖周有相連的病損組織?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：①患者有系統(tǒng)性疾病；②患牙有牙周病變；③患牙為牙周牙髓聯(lián)合病變；④過去6個(gè)月內(nèi)服用抗生素或非甾體類抗炎藥物。獲取標(biāo)本后用液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。在進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，所有患者簽署知情同意書。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)

1.3.1 RNA提取 根據(jù)Trizol試劑盒說明書操作。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度測(cè)定A值，260 nm/280 nm均在1.8～2.2，記錄提取的總RNA濃度，單位為ng/μl。操作完成后，凍存于-80℃冰箱或直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.2 RT-PCR 反應(yīng) 按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme）配置25μl反應(yīng)體系，加入反應(yīng)體系中RNA的量約為300 ng。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)：Foxp3引物序列：上游引物序列：5'-GTGGCCCGGATGTGAGAAG-3'，下游引物序列5'-GGAGCCCTTGTCGGATGATG-3'，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為238 bp。IL-10引物序列：上游引物序：5'-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3'，下游引物序列5'-TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3'，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為112 bp。以β-actin為內(nèi)參照物，其上游引物序列：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物序列5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為285 bp引物均由北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為94℃，5 min；35個(gè)PCR循環(huán)（94℃，30 s；72℃，1 min）；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠分離，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)掃描后測(cè)量譜帶強(qiáng)度。

1.4 Western-blot檢測(cè)

取出適量標(biāo)本，室溫融化，加入150μl裂解液，反復(fù)吹打以充分裂解細(xì)胞，用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)蛋白定量后按20μg/孔行10%聚丙烯酰胺（10%SDS-PAGE）電泳并經(jīng)濕式轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉后，取一抗稀釋液（TBST液）按照1∶1 000稀釋Foxp3，IL-10抗體，4℃搖床過夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀釋的二抗，室溫振搖孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法顯色、曝光后測(cè)量X光膠片上條帶密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR結(jié)果

通過RT-PCR比較健康對(duì)照組和慢性根尖炎組Treg細(xì)胞相關(guān)因子Foxp3、IL-10 mRNA表達(dá)的差異。在健康牙齦組織和慢性根尖周炎病損組織中均有不同程度Foxp3、IL-10 mRNA的表達(dá)，并且慢性根尖周炎組Foxp3、IL-10 mRNA的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，2組間差異顯著（P＜0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，表1）。

2.2 Western-blot檢測(cè)結(jié)果

通過Western-blot檢測(cè)健康牙齦組織和慢性根尖周炎病損組織Foxp3和IL-10蛋白表達(dá)情況。在健康牙齦組織和慢性根尖周炎病損組織中均有Foxp3和IL-10蛋白表達(dá)。與健康對(duì)照組相比，慢性根尖周炎組中Foxp3和IL-10蛋白表達(dá)水平增高，2組間表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，表2）。

圖1 2組中Foxp3、IL-10的mRNA表達(dá)Fig 1 The mRNA expression of Foxp3 and IL-10 in the 2 groups

表1 2組中Foxp3、IL-10的mRNA表達(dá)及比較 （±s）Tab 1 The mRNA expression of Foxp3 and IL-10 in the 2 groups（±s）

表1 2組中Foxp3、IL-10的mRNA表達(dá)及比較 （±s）Tab 1 The mRNA expression of Foxp3 and IL-10 in the 2 groups（±s）

注：①與健康對(duì)照組相比，P＜0.01

檢測(cè)指標(biāo) 健康對(duì)照組 慢性根尖周炎組 t值 P值Foxp3 0.310±0.078 0.553±0.099①7.419 0.000 IL-10 0.502±0.092 0.703±0.104①5.615 0.000

圖2 2組中Foxp3、IL-10的蛋白表達(dá)Fig 2 The protein expression of Foxp3 and IL-10 in the 2 groups

表2 2組中Foxp3、IL-10的蛋白表達(dá)及比較 （±s）Tab 2 The protein expression of Foxp3 and IL-10 in the 2 groups（±s）

表2 2組中Foxp3、IL-10的蛋白表達(dá)及比較 （±s）Tab 2 The protein expression of Foxp3 and IL-10 in the 2 groups（±s）

注：①與健康對(duì)照組相比，P＜0.01

檢測(cè)指標(biāo) 健康對(duì)照組 慢性根尖周炎組 t值 P值Foxp3 0.319±0.122 0.500±0.143①3.835 0.010 IL-10 0.352±0.162 0.683±0.093①7.086 0.000

3 討 論

慢性根尖周炎是口腔內(nèi)科的常見病，表現(xiàn)為炎性肉芽組織的形成和牙槽骨破壞。來自根管系統(tǒng)的細(xì)菌感染是慢性根尖周炎主要的致病因素。研究發(fā)現(xiàn)病原菌侵入到根尖周組織后，在局部趨化因子的作用下，區(qū)域病原菌特異性CD4+T細(xì)胞活化、增殖并浸潤(rùn)到病損根尖周組織中在微環(huán)境的影響下分化為不同的細(xì)胞亞群并發(fā)揮抗炎性或促炎性作用［15-16］。

Treg細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞亞群具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，通過細(xì)胞間直接接觸或分泌細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等方式，抑制體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用［17］。Foxp3是Treg細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育、分化及功能的發(fā)揮必不可少。清除Treg細(xì)胞內(nèi)的Foxp3則導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能喪失，并且效應(yīng)性T細(xì)胞功能加強(qiáng)，免疫促進(jìn)相關(guān)因子表達(dá)增多［18］。陽莎莎等［19］在研究Foxp3的表達(dá)與大鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎骨吸收的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在根尖周炎急性期Foxp3的表達(dá)水平較低，破骨細(xì)胞增多伴隨骨吸收加重；而在根尖周炎慢性期Foxp3的表達(dá)增高，破骨細(xì)胞數(shù)目減少且骨吸收無擴(kuò)大趨勢(shì)。提示Treg細(xì)胞可能在根尖周炎控制炎癥進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。Campos等［20］發(fā)現(xiàn)在根尖肉芽腫和根尖囊腫的非活動(dòng)性病損組織中Foxp3的表達(dá)增高，并且與IL-10和TGF-β的表達(dá)水平正相關(guān)，表明Foxp3調(diào)控Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能（包括免疫抑制和緩解炎癥反應(yīng)）的發(fā)揮，提示根尖病損組織中抗炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β可能主要來源于Treg細(xì)胞。IL-10作為抗炎性細(xì)胞因子，通過抑制過度活化的效應(yīng)T細(xì)胞，以及下調(diào)促炎因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，抑制病變組織炎癥發(fā)展，抑制骨吸收［21］。Sasaki等［22］在實(shí)驗(yàn)性小鼠牙髓感染誘導(dǎo)的根尖骨吸收模型中發(fā)現(xiàn)IL-10缺乏小鼠的根尖骨吸收明顯加重，體外研究發(fā)現(xiàn)IL-10以劑量依賴性方式抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1β的產(chǎn)生，表明IL-10在抑制感染誘導(dǎo)根尖周骨吸收中發(fā)揮重要的作用。Garlet等［11］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)牙周組織發(fā)生破壞時(shí)，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，相應(yīng)的細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β）表達(dá)降低，而在組織修復(fù)期，病變恢復(fù)期時(shí)，病變牙齦組織中出現(xiàn)增多的Treg，并且Treg相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)。與上述研究結(jié)果相一致，該研究發(fā)現(xiàn)在健康牙齦組織和慢性根尖周炎病損組織中均存在Treg細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，并且慢性根尖周炎病損組織中Foxp3和IL-10表達(dá)顯著高于健康牙齦組織，表明在慢性根尖周炎中Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，提示Treg細(xì)胞參與維持根尖周組織穩(wěn)態(tài)和組織損傷的修復(fù)。

此外，Th17細(xì)胞作為一種具有炎性效應(yīng)的免疫細(xì)胞，特征性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)核孤兒受體（retinoid-related orphan receptor gammar，RORγt），通過分泌IL-17等促炎性細(xì)胞因子在自身免疫性疾病、腫瘤以及感染性疾病中發(fā)揮重要作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)在人和動(dòng)物的慢性根尖周病損組織中均有Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)［24-26］，并且在根尖周病損組織中，與非活動(dòng)性病損組織相比，活動(dòng)性病損組織中IL-17的表達(dá)顯著增高［27］。Yang等［28］利用實(shí)驗(yàn)性大鼠根尖炎模型，通過動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)在根尖周組織的破壞過程中IL-17+細(xì)胞顯著增多。以上研究結(jié)果表明IL-17在慢性根尖周炎的組織破壞中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)性小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型中部分Treg細(xì)胞能夠共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt，在微環(huán)境作用下轉(zhuǎn)變成Foxp3+IL-17+T細(xì)胞，分泌IL-17，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的進(jìn)展和組織損傷。特異性阻斷內(nèi)源性Foxp3+RORγt+Treg細(xì)胞中RORγt的活化能有效地緩解病情和組織破壞［29-30］。Okui等［31］采用免疫熒光的方法在牙周炎的病損牙齦組織中檢測(cè)到Foxp3+IL-17+細(xì)胞，并且通過流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)在病損組織中Foxp3+IL-17+細(xì)胞在Foxp3+細(xì)胞中的比例明顯增高。上述研究結(jié)果提示Treg細(xì)胞具有可塑性，除具有免疫調(diào)節(jié)作用外，在一定條件下還可發(fā)揮促炎性效應(yīng)。該研究中發(fā)現(xiàn)，雖然在慢性根尖周炎中Treg相關(guān)因子表達(dá)增高，但是不能有效地抑制根尖周組織的炎癥進(jìn)展和組織損傷，分析可能的原因有2個(gè)方面：一方面，Treg分泌的抑炎性細(xì)胞因子的效能不足，不能有效地對(duì)抗炎性細(xì)胞因子對(duì)根尖周組織的破壞作用；另一方面，Treg細(xì)胞在微環(huán)境作用下通過生成促炎性細(xì)胞因子，發(fā)揮促炎性作用，進(jìn)而加重根尖周組織的炎癥反應(yīng)和組織破壞。

綜上所述，在健康牙齦組織和慢性根尖周炎病損組織中均存在Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子FoxP3和IL-10的表達(dá)，并且慢性根尖周炎病損組織中Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)顯著高于健康牙齦組織，表明在慢性根尖周炎中Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)。此外，Treg細(xì)胞分泌的抗炎性細(xì)胞因子的效能不足和Treg細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子的炎性作用可能是導(dǎo)致Treg細(xì)胞不能發(fā)揮有效抗炎作用的原因。推測(cè)Treg細(xì)胞在慢性根尖周炎的發(fā)病過程中可能發(fā)揮抑炎和促炎雙向調(diào)節(jié)作用，但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。