張鐵山， 尚曙玉， 王聰穎， 張智強(qiáng)

（1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州450005；2.天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，天津300301）

斯皮諾素是從鼠李科植物酸棗Ziziphus jujube Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 中分離得到的黃酮類化合物［1］，其性平，味甘、酸，歸肝、膽經(jīng)，具有抗抑郁、抗心律失常、催眠、鎮(zhèn)靜、抗氧化等多種藥理活性［1-3］，但其水溶性很差［4］，從而限制了療效發(fā)揮及臨床應(yīng)用。作為藥食同源兩用品［5］，開(kāi)發(fā)出斯皮諾素高生物利用度制劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，但目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道［6］。

固體分散體［7-9］由于制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，常作為改善中藥難溶性藥物的制劑技術(shù)之一，而近年來(lái)磷脂復(fù)合物固體分散體也逐漸受到國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注［10-12］，它是在一定條件下將難溶性藥物與磷脂制成磷脂復(fù)合物后，進(jìn)一步采用親水性高分子材料形成固體分散體。本實(shí)驗(yàn)分別制備了斯皮諾素固體分散體、磷脂復(fù)合物固體分散體，并比較了兩者體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Bell-ennium 型加熱磁力攪拌器（上海書(shū)俊儀器有限公司）；FA1004 型電子分析天平（上海光學(xué)儀器廠）；XD-5000A 型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦混合儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；TF-008-W 型氮?dú)獯祾邇x（瑞誠(chéng)科學(xué)儀器公司）；HTZ-92-01 型恒溫振蕩器（上海精怡科學(xué)儀器公司）；D8 型粉末衍射儀（德國(guó)布魯克公司）。

1.2 試藥 斯皮諾素對(duì)照品（批號(hào)T171220，瑞芬思生物科技有限公司）；斯皮諾素原料藥（批號(hào)160615001S，湖北巨勝科技有限公司， 含有量＞98%）；鹽酸普萘洛爾（批號(hào)100783-201401，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；卵磷脂（批號(hào)PC-98T，輔必成上海醫(yī)藥科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVK K30， 批 號(hào) 25000240379， 亞 什 蘭 集 團(tuán)公司）。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量200 ～240 g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK（豫）2016-0001，實(shí)驗(yàn)前1 d 領(lǐng)取。

2 方法與結(jié)果

2.1 斯皮諾素含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.15%磷酸（40 ∶60）；檢測(cè)波長(zhǎng)336 nm；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 方法學(xué)考察 精密稱取斯皮諾素對(duì)照品10.0 mg 至50 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解，定容至刻度，混勻，取適量用流動(dòng)相逐步稀釋，配制成50.0、 25.0、 5.0、 0.5、 0.05 μg／mL， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.041 2X-1.208 3（r＝0.999 8），在0.05 ～50.0 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。取低 （0.05 μg／mL）、 中 （25.0 μg／mL）、 高（50.0 μg／mL） 質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD 均小于0.45%，表明儀器精密度良好；平均加樣回收率分別為99.01%、100.26%、100.09%，RSD 均小于1.66%；室溫下于5 d 內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD 為0.66%，表明溶液在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 固體分散體制備及X 射線粉末衍射（XRPD）分析 采用溶劑揮發(fā)法制備固體分散體。取斯皮諾素0.2 g、PVP K30 1.2 g，加入100 mL 無(wú)水乙醇中，50 ℃下攪拌4 h，減壓旋蒸盡量除盡有機(jī)溶劑，即得，置于45 ℃真空干燥箱中24 h，敞口置于干燥器中。

XRPD 掃描分析條件為銅靶；管壓40 kV；掃描范圍3°～45°；掃描速度8°／min，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，斯皮諾素以典型結(jié)晶狀態(tài)存在，而在固體分散體中轉(zhuǎn)變成無(wú)定型狀態(tài)；同比例物理混合物中原料藥的特征晶型峰仍可觀察到，表明其結(jié)晶狀態(tài)未得到改變。

圖1 固體分散體XRPD 圖Fig.1 XRPD pattern for solid dispersions

2.3 磷脂復(fù)合物固體分散體制備及XRPD 分析 取斯皮諾素0.2 g、卵磷脂0.25 g，置于50 mL 四氫呋喃中，45 ℃水浴攪拌4.0 h，真空旋蒸除去四氫呋喃，即得磷脂復(fù)合物。取0.2 g，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

對(duì)磷脂復(fù)合物及其固體分散體進(jìn)行晶型分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，斯皮諾素典型晶型峰在磷脂復(fù)合物中消失，呈無(wú)定型狀態(tài)；制成磷脂復(fù)合物固體分散體后，它同樣以無(wú)定型狀態(tài)存在，表明制備成功。

圖2 磷脂復(fù)合物固體分散體XRPD 圖Fig.2 XRPD pattern for phospholipid complex solid dispersions

2.4 表觀溶解度比較 取過(guò)量斯皮諾素、固體分散體、磷脂復(fù)合物、磷脂復(fù)合物固體分散體，加到10 mL 經(jīng)超聲處理后的蒸餾水中，固定于25 ℃恒溫?fù)u床上平衡2 d，15 000 r／min 下離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，測(cè)定溶解度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，固體分散體、磷脂復(fù)合物、磷脂復(fù)合物固體分散體均可顯著提高斯皮諾素溶解度（P＜0.01）。

2.5 體外溶出度比較 取斯皮諾素、固體分散體、磷脂復(fù)合物、磷脂復(fù)合物固體分散體適量（以斯皮諾素計(jì)，含有量均為30 mg），2 mL 蒸餾水制成混懸液后置于活化處理的透析袋（7 000～14 000 Da）中，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速100 r／min，以900 mL 超聲處理后的蒸餾水為釋放介質(zhì)，于180 min 內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)取樣3 mL，補(bǔ)加釋放介質(zhì)以保持總體積不變，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，HPLC 法測(cè)定斯皮諾素含有量，繪制溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，固體分散體、磷脂復(fù)合物、磷脂復(fù)合物固體分散體可提高斯皮諾素體外溶出度，以固體分散體、磷脂復(fù)合物固體分散體更明顯。

表1 溶解度考察結(jié)果（，n＝3）Tab.1 Results of solubility investigation（，n＝3）

表1 溶解度考察結(jié)果（，n＝3）Tab.1 Results of solubility investigation（，n＝3）

注：與斯皮諾素比較，**P＜0.01

樣品 1表觀溶解度2／（μ g·mL-1）3平均值／（μg·mL-1）斯皮諾素 12.43 12.40 12.47 12.43±0.04固體分散體 139.70 139.92 139.86 139.82±0.11**磷脂復(fù)合物 26.53 26.39 26.44 26.45±0.07**磷脂復(fù)合物固體分散體 144.23 144.30 144.24 144.26±0.04**

圖3 樣品體外溶出曲線Fig.3 In vitro dissolution curves for samples

2.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為研究

2.6.1 灌胃液制備 取斯皮諾素及其固體分散體、磷脂復(fù)合物固體分散體適量，0.5%CMC-Na 溶液配制成10.0 mg／mL 混懸液 （以斯皮諾素計(jì)），即得。

2.6.2 分組、給藥及血樣采集［13］18 只大鼠隨機(jī)分為3 組，給藥前禁食不禁水12 h，按20 mg／kg劑量灌胃給予斯皮諾素、固體分散體、磷脂復(fù)合物固體分散體混懸液后，于0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16、24 h 眼眶取血各0.3 mL，同時(shí)補(bǔ)充適量生理鹽水，4 000 r／min 低溫離心2 min，血漿置于-20 ℃冰箱中保存。

2.6.3 內(nèi)標(biāo)、對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸普萘洛爾對(duì)照品10 mg 至10 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解并定容至刻度，流動(dòng)相稀釋至400.0 ng／mL，即得內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取斯皮諾素對(duì)照品10 mg 至50 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解，室溫下放置0.5 h后定容至刻度，得200 μg／mL 貯備液，乙腈稀釋至800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、10 ng／mL，即得對(duì)照品溶液。

2.6.4 樣品處理 吸取血漿100 μL、內(nèi)標(biāo)溶液（50.0 ng／mL）50 μL 至離心管中，加入1.5 mL 乙腈后渦旋6 min，分層后轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相，調(diào)節(jié)氮?dú)獯邓俸缶徛等ビ袡C(jī)溶劑，100 μL 流動(dòng)相復(fù)溶沉淀物，轉(zhuǎn)移至帶內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

2.6.5 線性關(guān)系考察 取“2.6.3” 項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各500 μL，45 ℃氮?dú)饩徛蹈?，加?空 白 血 漿500 μL、 內(nèi) 標(biāo) 溶 液50 μL， 按“2.6.4” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），斯皮諾素與鹽酸普萘洛爾峰面積之比為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y ＝0.003 2X-0.151 2 （R2＝0.990 9）， 在10 ～800.0 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 斯皮諾素HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of spinosin

2.6.6 方法學(xué)考察 取10.0 ng／mL （低）、400.0 ng／mL（中）、800.0 ng／mL（高） 質(zhì)量濃度血漿溶液， 日內(nèi)精密度 （n ＝3） RSD 均小于10.66%， 日 間 精 密 度 RSD （n ＝3） 均 小 于10.26%，表明該方法精密度良好；血漿樣品于5 d內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得斯皮諾素、內(nèi)標(biāo)峰面積比值無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明樣品在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。100 μL 空白血漿配制成10.0、400.0、800.0 ng／mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將斯皮諾素、內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入“2.6.5” 項(xiàng)下回歸方程，測(cè)得3 種質(zhì)量濃度的方法回收率在86.96%～91.44%之間。

2.6.7 測(cè)定結(jié)果 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)3P97 程序統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，再繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，固體分散體、磷脂復(fù)合物固體分散體主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)較斯皮諾素均有顯著變化（P＜0.05，P＜0.01）；與前者比較，后者tmax顯著性延長(zhǎng)（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著升高（P＜0.05），兩者相對(duì)生物利用度分別增加到219.61%、265.39%。

表2 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（，n＝6）

表2 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（，n＝6）

注：與斯皮諾素比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與固體分散體比較，*P＜0.05，**P＜0.01

參數(shù) 單位 斯皮諾素 固體分散體 磷脂復(fù)合物固體分散體tmax h 5.55±0.88 3.38±0.69△ 5.92±0.93**Cmax ng·mL-1 142.36±36.68 316.51±93.82△△ 406.11±108.02△△*AUC0～t ng·mL-1·h 1 033.75±182.34 2 270.28±426.19△△ 2 743.40±577.27△△*AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 046.14±190.68 2 291.65±443.27△△ 2 861.93±597.89△△*

3 討論

口服制劑進(jìn)入胃腸道后，需經(jīng)溶解溶出才能被吸收進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)揮其藥理作用，但難溶性藥物溶解度很差，導(dǎo)致其溶出受到極大限制，故提高其溶解度、溶出度成為提高口服吸收生物利用度的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)顯示，將斯皮諾素制備成固體分散體后以無(wú)定型狀態(tài)存在，其溶解度、體外溶出度均明顯改善， 相對(duì)生物利用度增加到219.61%，有助于發(fā)揮其藥效；與原料藥相比，固體分散體tmax顯著提前（P＜0.05），可能與其促進(jìn)藥物快速溶出有關(guān)［7］，但磷脂復(fù)合物固體分散體tmax與其相比又顯著延后（P＜0.01），可能是由于它可提高原料藥親脂性［4］，導(dǎo)致在胃腸道黏膜中發(fā)生了滯留［12-14］，同時(shí)其相對(duì)生物利用度增加到265.39%，Cmax、AUC0～t和AUC0～∞也顯著提高。

據(jù)報(bào)道［14-17］，磷脂復(fù)合物技術(shù)有助于改善藥物脂溶性，而將其制成固體分散體后對(duì)斯皮諾素水溶性的改善也會(huì)產(chǎn)生積極影響，并進(jìn)一步增加原料藥體內(nèi)吸收。另外，由于磷脂復(fù)合物本身黏性較強(qiáng)，故提高斯皮諾素累積溶出度的程度有限，這也印證了繼續(xù)將其制成固體分散體的必要性。

圖5 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for samples

總之，將磷脂復(fù)合物、固體分散體技術(shù)聯(lián)用時(shí)，對(duì)提高水溶性、脂溶性均較差藥物的口服吸收生物利用度具有較好的借鑒意義，本實(shí)驗(yàn)也為斯皮諾素今后相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)［18-19］。