貴州大學釀酒與食品工程學院 貴州貴陽 550025

隨著肉類加工的不斷發(fā)展尋找合適的發(fā)酵劑，縮短發(fā)酵時間、降低安全風險成為發(fā)酵肉制品的關鍵點[1]。發(fā)酵制品往往是潛在的發(fā)酵菌來源[2]，從發(fā)酵肉制品中分離出的細菌主要有乳酸桿菌屬和乳酸片球菌屬，這兩種細菌可代謝乳酸降低pH值來抑制病原菌的生長，提高其安全性。乳酸菌在發(fā)酵過程中可促進Maillard反應、脂質(zhì)降解或氧化[3]、蛋白質(zhì)水解[4]、碳水化合物發(fā)酵及氨基酸分解代謝等，同時產(chǎn)生與肉制品相關的風味[5]。

發(fā)酵肉的風味同樣來自于霉菌及酵母等對肉中脂肪、蛋白質(zhì)的分解[6]。霉菌常存在于干發(fā)酵香腸，使產(chǎn)品具有干香腸特殊的芳香氣味和外觀。霉菌所代謝的酶具有蛋白分解和脂肪分解能力，因此有利于產(chǎn)品風味的形成，且生長在產(chǎn)品表面，可以隔氧，防止酸敗。大多數(shù)根霉脂肪酶具有Sn-1(3)位置特異性[7]，將適量具有這一特性的脂肪酶加入香腸中可以顯著增加香腸的香氣，加速脂肪的氧化及水解[8]，并促進揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成。本研究將乳酸片球菌與米根霉分別制備為菌劑，利用最佳發(fā)酵工藝制備羊肉發(fā)酵香腸，通過CO組與CO+PR組對比分析羊肉發(fā)酵香腸風味物質(zhì)，探究復配菌劑對羊肉發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CICC10344乳酸片球菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

ATCC96382米根霉，廣東省微生物菌種保藏管理中心；

十一碳酸甘油三脂，Sigma公司；

正己烷、甲醇，色譜純；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TGL20M臺式高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設備有限公司；

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

FD-1A-50真空冷凍干燥機，江蘇天翔儀器有限公司；

Agilent7820A氣相色譜儀(美國安捷倫公司)，自動進樣塔；

ParkerH2PEM-165氫氣發(fā)生器(美國派克公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

乳酸片球菌按說明書活化2代，接種于乳酸片球菌種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，再從種子培養(yǎng)基中取2%菌液加入乳酸片球菌擴大培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，6 000r/min離心10min，去上清液，用生理鹽水清洗3次，加入無菌水，調(diào)整活菌數(shù)至108cfu/mL。

米根霉按說明書活化2代，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～5d，取斜面培養(yǎng)基[9]加入5mL無菌水并輕輕刮下孢子，重復清洗3次，合并孢子液于有玻璃珠的三角瓶中，反復振蕩后用帶有滅菌脫脂棉的漏斗過濾，得到孢子液，調(diào)整孢子液濃度為107cfu/mL。

1.3.2 保護劑制備

將脫脂乳和海藻糖分別配制為30%、25%、20%、15%、10%(w/v)5個濃度；山梨糖醇和甘露醇分別配制為6%、9%、12%、15%、18%(w/v)5個濃度；甘油配制為2%、6%、10%、14%、18%。脫脂乳滅菌時間為115℃，10min，其余均為121℃，15min。

凍干試驗中，脫脂乳和海藻糖的濃度分別為15%、12.5%、10%、7.5%、5%(w/v)；山梨糖醇和甘露醇的濃度分別為3%、4.5%、6%、7.5%、9%(w/v)；甘油濃度為1%、3%、5%、7%、9%。

1.3.3 菌劑制備實驗

以冷凍干燥活菌數(shù)為指標，探究海藻糖、脫脂乳、山梨糖醇、甘露醇和甘油等保護劑對菌種存活率的影響。在此基礎上設計L9(34)正交試驗。

1.3.3.1 真空冷凍干燥

分別取5個梯度濃度保護劑液體1.0mL，再加入調(diào)整后的菌泥懸浮液1.0mL。室溫下平衡30min放置于-78℃超低溫冰箱中冷凍3h取出置于冷凍干燥機中干燥24h。

1.3.3.2 活菌計數(shù)

活菌計數(shù)參照Zayed G, Roos Y H.[10](2004)等方法進行。

1.3.4 羊肉發(fā)酵香腸制備方法

CO組：羊肉瘦肥以8∶2配比，加入1.5%鹽，0.7%蔗糖，2%高度白酒，15%冰水，于4℃下冷藏24h。

CO+PR組：羊肉瘦肥以8∶2配比，加入1.5%鹽，0.7%蔗糖，2%高度白酒，15%冰水，于4℃冷藏24h。取出后加入2%復配菌劑，菌劑復配比例(RO∶PA)為1∶1。

將空白組與菌劑組分別灌腸，于32℃下發(fā)酵16h，再于15℃下干燥1d，10℃下干燥2d，5℃下干燥2d即得羊肉發(fā)酵香腸成品。

1.3.5 羊肉香腸風味測定

通過頂空固相微萃取(HS-SPME)提取具有發(fā)酵香腸頂空瓶的頂部空間中的揮發(fā)性化合物。取2.0g樣品，置于10mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm-50/30μmDVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在70℃條件下頂空萃取40min，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250℃)中，熱解析3min進樣。

氣相色譜條件：色譜柱為FB-5(30m×0.25mm×0.25μm)彈性石英毛細管柱，柱溫40℃(保留2min)，以4℃/min升溫至240℃，運行時間52min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓6.84psi，載氣流量1.0mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1min。

MS條件：離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1 706V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍29～450amu。

定性定量分析：對總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索、人工解析圖譜及與Nist2005和Wiley275質(zhì)譜庫匹配，并參考有關文獻定性確定化合物，用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對百分含量

1.4 統(tǒng)計分析

通過單因素方差分析(ANOVA)細胞存活率，利用Origin8.5軟件對數(shù)據(jù)進行處理。使用Fisher最小顯著性差異檢驗(5%)比較平均值(HSD0.05)。

2 結果與討論

2.1 菌劑制備試驗

2.1.1 海藻糖(TER)與脫脂乳(SM)對乳酸片球菌存活率的影響

由圖1可知，當脫脂乳保護劑添加量達到10%時，其最高存活率為30.37±1.28%，即活菌數(shù)為23.99×108cfu/g。未添加保護劑的乳酸片球菌存活率為0.84±0.33%，與添加保護劑后的冷凍干燥乳酸片球菌存活率相比增加了29.53±0.95%。但高濃度的脫脂乳中含有大量乳糖及蛋白，使細胞內(nèi)部形成較強的玻璃化結構反而不利于細胞存活。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，脫脂乳各濃度間差異極顯著(p<0.01)，濃度為10%與其他添加濃度間呈極顯著差異(p<0.01)，其他濃度間差異不顯著(p>0.05)。

圖1 海藻糖與脫脂乳對乳酸片球菌存活率的影響Fig. 1 The protective effect of trehalose and skim milk on Pediococcus acidilactici

海藻糖作為保護劑時，其趨勢與脫脂乳類似。當海藻糖添加量為10%時，有最高存活率為28.15±1.27%。統(tǒng)計分析，海藻糖各濃度間差異顯著(p<0.05)，濃度添加量為15%與添加量12.5%呈顯著性差異(p<0.05)；添加量為15%與添加量10%呈極顯著差異(p<0.01)；其他添加量之間差異不顯著(p>0.05)。海藻糖屬于二糖，C.Dini[11](2013)等研究發(fā)現(xiàn)海藻糖對于菌種具有較好的保護作用，主要是細胞表面存在磷脂、蛋白質(zhì)等，糖類可通過與細胞表面的氫鍵相互作用以代替蛋白質(zhì)表面的水分子，從而在干燥完成后穩(wěn)定其極性基團。

2.1.2 山梨糖醇(SOL)與甘露醇(MAN)對乳酸片球菌存活率的影響

由圖2可知，在添加4.5%山梨糖醇后其存活率最高為20.00±1.56%。山梨酸鉀各濃度間差異極顯著(p<0.01)，添加量4.5%與添加量6%間呈差異顯著(p<0.05)，添加量4.5%與其他添加量之間呈差異極顯著(p<0.01)，其他各濃度間不存在顯著性差異。

圖2 山梨糖醇與甘露醇對乳酸片球菌存活率的影響Fig. 2 The protective effect of sorbitol and mannitol on Pediococcus acidilactici

添加濃度4.5%的甘露醇后存活率最高為22.74±1.17%，甘露醇各濃度間差異極顯著(p<0.01)，添加量4.5%與添加量6%間呈差異顯著(p<0.05)，添加量4.5%與其他添加量之間呈差異極顯著(p<0.01)，添加量6%與7.5%間差異不顯著，添加量6%與其他添加量間差異顯著(p<0.05)，其他各濃度間差異不顯著。甘露糖醇的保護作用主要是由于甘露糖醇的表面親和力較高[12]，可以將細胞進行包被，保護細胞在極端條件下存活。Anasal-Hussein[13](2012)等研究發(fā)現(xiàn)甘露醇可以在儲存5個月后顯著改善菌種生存能力。

2.1.3 甘油(GLY)對乳酸片球菌存活率的影響

由圖3可知，添加甘油后其存活率最高為11.41±0.67%，甘油各濃度間差異不顯著(p>0.05)，說明甘油不適合保存乳酸片球菌。在本試驗中可明顯看出甘油保護乳酸片球菌的效果并不理想，這與朱東升[14](2010)等制備乳酸菌菌粉時使用甘油的研究結果相似。甘油對乳酸片球菌的保護能力較弱，可能與滲透型保護劑使用濃度滲入細胞的能力有關[15]。

圖3 甘油對乳酸片球菌存活率的影響Fig. 3 The protective effect of glycerol on Pediococcus acidilactici

2.1.4 乳酸片球菌粉保護劑正交試驗結果

由單因素試驗結果選擇海藻糖(TER)、脫脂乳(SM)、甘露糖醇(MAN)進行L9(34)正交試驗。測定未冷凍干燥的乳酸片球菌活菌數(shù)為3.95×108cfu/g，表1為正交試驗結果。

表1 乳酸片球菌保護劑正交試驗及分析

注：k為空列。

由表1可知，影響乳酸片球菌存活率的主次因素為TER>SM>MAN，即海藻糖濃度>脫脂乳濃度>甘露醇濃度。海藻糖濃度對乳酸片球菌存活率具有及其顯著的影響(p<0.01)，脫脂乳與甘露醇對米根霉孢子存活率的影響較小。因此制備乳酸片球菌保護劑的最佳復配條件為海藻糖10%，脫脂乳10%，甘露醇3.5%，此條件下的存活率可達77.07±2.32%。

2.2 米根霉孢子粉制備

2.2.1 海藻糖(TER)與脫脂乳(SM)對米根霉孢子存活率的影響

由圖4可知，海藻糖對米根霉孢子的保護作用呈先上升后下降的趨勢，當海藻糖濃度為10%時米根霉孢子存活率達到27.47±1.92%。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，海藻糖各濃度間差異顯著(p<0.05)，海藻糖濃度為10%時與濃度5%、15%之間呈差異顯著(p<0.05)，其他濃度間差異不顯著(p>0.05)。

圖4 海藻糖與脫脂乳對米根霉孢子存活率的影響Fig. 4 The protective effect of trehalose and skim milk on spore power of Rhizopus oryzae

脫脂乳對米根霉孢子的保護趨勢與海藻糖類似，當脫脂乳濃度為10%時米根霉存活率達到26.22±1.96%。脫脂乳各濃度間差異顯著(p<0.05)，當脫脂乳濃度為10%時與濃度5%間呈差異顯著(p<0.05)，其他濃度間差異不顯著(p>0.05)。

2.2.2 山梨糖醇(SOL)與甘露糖醇(MAN)對米根霉孢子存活率的影響

由圖5可知，山梨糖醇濃度為6%時，米根霉孢子存活率為12.48±1.49%。甘露糖醇濃度為6%時，米根霉孢子存活率為11.24±1.54%。山梨糖醇與甘露糖醇各濃度間均不顯著(p>0.05)。山梨糖醇與甘露糖醇對米根霉孢子的保護作用較差，可能是由于多元醇的保護機理是結合細胞壁上的蛋白質(zhì)形成糖蛋白對細胞進行保護，而真菌細胞壁的主要成分為多糖，蛋白質(zhì)占比小，無法將孢子完全包被[10]。

圖5 山梨糖醇與甘露糖醇對米根霉存活率的影響Fig. 5 The protective effect of sorbitol and mannitol on spore power of Rhizopus oryzae

2.2.3 甘油(GLY)對米根霉孢子存活率的影響

由圖6可知，甘油濃度為5%時對米根霉孢子有最佳保護作用，此時存活率為19.98±1.14%。甘油各濃度間差異顯著(p<0.05)，當甘油濃度為5%時與濃度1%間呈差異顯著關系(p<0.05)；其他甘油濃度間差異不顯著(p>0.05)。甘油能透過米根霉孢子的細胞壁，進入細胞內(nèi)，使細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，細胞內(nèi)壓力接近于細胞外壓力，降低細胞外干燥或凍結引起細胞脫水皺縮的程度和速度，從而減少冷凍干燥過程對細胞的損傷。

圖6 甘油對米根霉孢子存活率的影響Fig. 6 The protective effect of glycerol on spore power of Rhizopus oryzae

2.2.4 米根霉孢子粉正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗選擇海藻糖(TER)、脫脂乳(SM)和甘油(GLY)進行L9(34)正交試驗。測定未冷凍干燥的米根霉活菌數(shù)為2.86×107cfu/g，表3為正交試驗結果。

表2 米根霉孢子保護劑正交試驗及分析

注：k為空列。

由表2可知，影響米根霉存活率的主次因素為TER>SM>GLY，即海藻糖濃度>脫脂乳濃度>甘油濃度。海藻糖濃度對米根霉存活率具有及其顯著的影響(p<0.01)，脫脂乳與甘油對米根霉孢子存活率的影響較小。方差分析結果表明，制備米根霉孢子保護劑的最佳復配條件為海藻糖10%，脫脂乳12.5%，甘油3.5%，此條件下米根霉孢子存活率可達73.79±2.57%。

2.3 羊肉發(fā)酵香腸風味分析

采用HS-SGME-GC/MS的方法對兩組羊肉發(fā)酵香腸進行分析，由表可知空白組(CO)共鑒定出60種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中醇、酯類相對含量最高分別為22.33%、67.138%。CO+PR組中酮、醇、酯相對含量較高，分別為30.911%、21.708%、39.512%。菌劑組(CO+PR)共鑒定出57種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酮類、醇類、酯類相對含量較高，分別為30.911%、21.708%、39.512%?？梢娧蛉獍l(fā)酵香腸的主要風味成分來自于醇類、酯類、醇類化合物。

通過對比空白組(CO)、菌劑組(CO+PR)的風味成分可知兩種羊肉香腸共同測出的揮發(fā)性風味物質(zhì)有55種。兩組香腸風味物質(zhì)種類上無明顯差異(p>0.01)，但是添加保護劑后的羊肉香腸中酮類物質(zhì)和酯類物質(zhì)含量差異顯著(p<0.01)。大多數(shù)酮起源于脂質(zhì)氧化，而有一些酮類則是通過美拉德反應形成，如：3-羥基丁-2-酮、甲基酮可通過微生物酯化產(chǎn)生，也可通過亞油酸氧化分解得到[16]。由表4、表5可知，與CO組相比，CO+PR組酮的相對含量較高，因此酮對CO+PR組的風味影響較大。CO組與CO+PR組的酯類含量均較高。其中，己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯在檢測中相對含量最高，這三種酯可能來自腌制時用的白酒，也有可能來自己酸、丁酸、辛酸與醇進行酯化反應得到，這些酸均能通過微生物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生[17～19]。

表4 羊肉發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味種類及相對含量

表5 羊肉發(fā)酵香腸中揮發(fā)性風味物質(zhì)相對含量及香味描述

續(xù)表5

類別風味物質(zhì)香味描述相對含量/%COCO+PR酸類2-甲基丙酸強烈刺激性氣味0.014———己酸汗臭味2.4470.315乙酸醋酸味———1.204酯類乙酸乙酯強烈的果香、酒香香氣、菠蘿香和香蕉的香味0.4940.615乙酸丙酯特殊的水果香味0.081———異丁酸乙酯水果和奶油香氣0.0530.09甲酸戊酯水果香味0.2620.26丁酸乙酯強烈的甜果香,有菠蘿、香蕉、蘋果氣息1.8660.885乳酸乙酯朗姆酒、水果和奶油的香氣0.7210.4142-甲基丁酸乙酯強烈蘋果皮、菠蘿皮和未成熟李子皮香氣0.1620.4843-甲基丁酸乙酯類似蘋果、香蕉的香氣和酸甜氣味0.2520.676乙酸異戊酯愉快的香蕉香味0.1890.014戊酸乙酯蘋果香氣0.5550.557γ-丁內(nèi)酯核桃味或甘草味0.0150.031己酸甲酯菠蘿似香氣0.0160.015己酸乙酯水果香氣味56.25531.391庚酸乙酯菠蘿香氣味1.3710.662-乙基-己酸乙酯0.0680.045辛酸乙酯白蘭地的香氣,并有甜味3.1962.227壬酸乙酯油脂、水果和白蘭地酒似香氣0.370.263癸酸乙酯椰子香味0.9510.729月桂酸乙酯花生香氣0.0430.028十四酸乙酯椰子和鳶尾似香氣和甜的蜂蠟似風味0.0790.05十六酸乙酯弱蠟香、果爵和奶油香氣0.0680.056油酸乙酯鮮花香氣0.0710.022萜烯類苯乙烯特殊香氣0.1070.195α-蒎烯松木、針葉及樹脂樣的氣息0.010.013脂肪烴十二烷刺激性氣味0.1070.081十三烷刺激性氣味0.0680.047十四烷刺激性氣味0.080.066雜環(huán)類2-戊基呋喃豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香韻0.0470.061其他檸檬油精極強的桔子、檸檬香氣0.0680.138

3 結論

在單因素實驗基礎上進行正交實驗，對制備乳酸片球菌菌粉與米根霉孢子粉的保護劑進行復配優(yōu)化，篩選出對乳酸片球菌菌粉與米根霉孢子粉存活率具有顯著影響的菌種配比：乳酸片球菌(海藻糖10%，脫脂乳10%，甘露醇3.5%)，米根霉(海藻糖10%，脫脂乳12.5%，甘露醇3.5%)。制備存活率較高的乳酸片球菌菌粉和米根霉孢子粉。利用最優(yōu)工藝條件制備菌劑發(fā)酵羊肉香腸共檢測出的揮發(fā)性風味物質(zhì)有55種，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在羊肉發(fā)酵香腸中添加菌劑后己醛、(E)-2-壬烯醛、己酸等亞油酸氧化產(chǎn)物減少，同時在加入菌劑后3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、乙酸等含量分別增加了27.02%，1.662%，1.204%，這些風味物質(zhì)氣味閾值低對羊肉整體風味貢獻較大，能改善羊肉發(fā)酵香腸風味。