闞勁松 - 張 敏 徐 濤

(合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽 合肥 230601)

β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)具有β-糖苷鍵水解和合成(轉(zhuǎn)糖苷)雙重活性作用[1-2]，微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。β-葡萄糖苷酶的水解作用源于非還原端斷裂β-糖苷鍵釋放D-葡萄糖和糖基配體，一方面可將纖維低聚糖和纖維二糖水解成葡萄糖，對(duì)纖維素糖化獲得單糖進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵具有關(guān)鍵性作用[4]，另一方面可將難以被人體吸收的天然糖苷類物質(zhì)如大豆苷等水解成易于吸收利用的苷元形式[5]，也可以酶解多種不同糖苷鍵合態(tài)的香味前體物質(zhì)，釋放天然香氣的風(fēng)味物質(zhì)[6]，在β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用下生成功能性低聚糖[7-8]，堿性條件下更有利于形成聚合物[9]。功能性低聚糖如低聚龍膽糖、低聚纖維寡糖等可以作為益生元的功能性糖類，其中低聚龍膽糖比麥芽糖漿具有更高的吸水性和較低的黏度，可防止食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，對(duì)雙歧桿菌具有較強(qiáng)的增殖作用[10]。

多數(shù)生物傾向于利用64種密碼子中的一部分，被頻繁利用的稱為最佳密碼子，未被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子，密碼子的偏愛(ài)性是影響外源蛋白質(zhì)異源表達(dá)的關(guān)鍵因素。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是發(fā)展迅速的真核表達(dá)系統(tǒng)[11]，相對(duì)原核表達(dá)來(lái)說(shuō)，其外源基因穩(wěn)定、分泌表達(dá)產(chǎn)物易于純化及能進(jìn)行蛋白翻譯后加工修飾等特性使其得到廣泛應(yīng)用，已成功表達(dá)幾種真核生物的β-葡萄糖苷酶基因[12-14]。由于畢赤酵母對(duì)密碼子的偏愛(ài)性，對(duì)目的基因的來(lái)源特別是原核基因序列需進(jìn)行優(yōu)化才能提高表達(dá)產(chǎn)物量。

前期研究已實(shí)現(xiàn)短小芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)，但大量表達(dá)產(chǎn)物易形成包涵體，導(dǎo)致酶活力較低，且需細(xì)胞破碎后才能分離產(chǎn)物。短小芽孢桿菌F1株β-葡萄糖苷酶基因中編碼部分氨基酸(Arg、Pro、Cys和Ala等)的密碼子在畢赤酵母中的使用頻率較低。試驗(yàn)擬將細(xì)菌Bacilluspumilus的β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，以期提高表達(dá)量和胞外酶活力，并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)，為β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)的應(yīng)用及后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)F1株：本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得并保藏；

E.coliDH5α：生工生物工程(上海)股份有限公司；

畢赤酵母GS115、畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA：美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基、質(zhì)粒提取試劑盒、博來(lái)霉素(Zeocin)、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、T4DNA連接酶、DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、凝膠回收試劑盒、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)R-250、Bradford蛋白質(zhì)試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

EcoR I、NotI、SacI：美國(guó)Fermentas(MBI)公司；

對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)：美國(guó)Sigma公司；

糖苷(七葉苷、苦杏仁苷、水楊苷、大豆苷、柚皮苷、D-海藻糖、熊果糖)、葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：Allegra 64R Centrifuge型，美國(guó)BECKMAN COULTER公司；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：Libra S22型，英國(guó)Biochrom 公司；

PCR儀：Applied Biosystems 2720 Therml Cycler型，美國(guó)ABI公司；

凝膠成像系統(tǒng)：BioSens 810型，上海山富科學(xué)儀器有限公司；

電穿孔儀：MicroPulser型，美國(guó)Bio-Rad公司；

高效液相色譜儀：Waters 1525/Alltech ELSD 2000ES型，美國(guó)Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶基因遺傳密碼的優(yōu)化設(shè)計(jì) 在保持氨基酸序列不變的前提下，以畢赤酵母密碼子使用頻率為基準(zhǔn)，利用密碼子優(yōu)化軟件(http://www.jcat.de)對(duì)β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得β-葡萄糖苷酶基因序列(bglK)。為方便基因重組和重組酶的純化，基因編碼序列5’端引入EcoR I限制酶位點(diǎn)，3’端增加6×His標(biāo)簽序列后再加上NotI限制酶位點(diǎn)。優(yōu)化后的全基因序列進(jìn)行人工合成后連接到pUC57載體，合成的全基因片段經(jīng)測(cè)序分析完全正確后，用于酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.2.2 畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 含有人工全合成基因的pUC57載體經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后，凝膠電泳分離基因bglK，T4連接酶16 ℃連接與經(jīng)相同雙酶切的pPICZαA載體片段，CaCl2法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，氨芐抗性(100 μg/mL)平板篩選重組菌，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序分析驗(yàn)證。重組質(zhì)粒pPICZαA-bglK經(jīng)SacI線性化后，加入200 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞并輕輕混勻，轉(zhuǎn)入2 mm預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置5 min，放入電轉(zhuǎn)化儀電擊后涂板，30 ℃培養(yǎng)2 d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，通過(guò)含不同Zeocin濃度(100，200，500，1 000 μg/mL)的YPD平板篩選多拷貝高表達(dá)轉(zhuǎn)化子。使用載體通用引物進(jìn)行PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，5’AOX引物序列：GACTGGTTCCAATTGACAAGC，3’AOX引物序列：GGATGTCAGAATGCCATTTGC，陽(yáng)性對(duì)照以pPICZαA-bglK質(zhì)粒為模板，pPICZαA-bglK轉(zhuǎn)化子記為GS115/pPICZαA-bglK。

1.2.3 畢赤酵母工程菌株的分泌表達(dá)與鑒定 將多拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子、GS115及GS115/pPICZαA空載畢赤酵母單克隆分別接種5.0 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，按10%的接種量轉(zhuǎn)種含25 mL BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600 nm為2～6，室溫離心收集菌體，輕輕倒出上清液，用BMMY液體培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至OD600 nm為1.0以誘導(dǎo)表達(dá)。30 ℃、250 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加適量100%甲醇至終濃度為1.5%。每24 h取樣，12 000 r/min離心10 min收集上清液即為粗酶液，分別進(jìn)行酶活力檢測(cè)、SDS-PAGE和Western Blotting鑒定。

(1) SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物：600 μL樣品菌懸液離心，取200 μL上清，采用生工TCA沉淀試劑盒沉淀蛋白，最終蛋白重懸液體積為20 μL，上樣量20 μL，濃縮膠80 V，20 min，分離膠120 V，60 min，凝膠電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色20 min，脫色。

(2) Western Blotting鑒定：檢測(cè)重組β-葡萄糖苷酶的表達(dá)情況[15]，制備聚丙烯酰胺凝膠為濃縮膠5%，分離膠12%，樣品20 μL上樣。電泳參數(shù)為濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，60 min。轉(zhuǎn)膜為濕轉(zhuǎn)，250 mA，52 min。5%脫脂奶粉封閉，37 ℃緩慢振蕩1 h。一抗為兔抗His標(biāo)簽，1∶500稀釋，37 ℃緩慢振蕩60 min孵育一抗。二抗為羊抗兔，1∶8 000稀釋，37 ℃緩慢振蕩60 min 孵育二抗，四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色。

1.2.4 重組β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定 800 μL的0.05 mol/L 甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液(pH 9.0)和100 μL的 45 mmol/L pNPG在45 ℃條件下預(yù)熱5 min，加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液100 μL，反應(yīng)10 min，加入2 mol/L Na2CO3溶液2 mL終止酶反應(yīng)，再加入10 mL蒸餾水混勻，取適量反應(yīng)液加入比色皿中，測(cè)定OD405 nm。β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 μmol底物pNPG 轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物pNP所需的酶量。

1.2.5 溫度對(duì)重組酶活性的影響 在25～60 ℃(間隔5 ℃)的不同溫度下測(cè)定酶活，確定重組酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液分別在45，50，55 ℃水浴中保溫處理3 h，間隔30 min取樣，測(cè)定樣品剩余酶活力，以保溫前(0 h)樣品的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，研究重組酶在不同溫度下殘留酶活隨時(shí)間變化情況，探究酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.6 pH對(duì)重組酶活性的影響 在最適溫度45 ℃條件下，測(cè)定重組β-葡萄糖苷酶在pH 4.0～8.0(磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液)、pH 9.0～10.0(甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液)條件下的酶活，確定最適反應(yīng)pH。將酶液于25 ℃分別在pH 4.0～10.0的緩沖液中保溫2 h后測(cè)定剩余酶活力，以未處理酶活力為100%，計(jì)算不同pH條件下的酶活變化情況。

1.2.7 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響 在最適酶反應(yīng)條件下，加入不同離子的溶液(終濃度為1，5 mmol/L)，以未加入金屬離子的酶活力為100%，測(cè)定重組β-葡萄糖苷酶在不同離子環(huán)境中的酶活力。

1.2.8 重組β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù) 以pNPG為底物，在45 ℃、pH 9.0條件下，測(cè)定不同底物濃度(0.25～40.00 mmol/L)下的反應(yīng)速度，利用底物濃度和對(duì)應(yīng)酶促反應(yīng)速度，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，分析重組酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax值[16]。

1.2.9 底物特異性 在最適酶反應(yīng)條件下，取終濃度為0.01 g/mL的糖苷類物質(zhì)作為底物，反應(yīng)時(shí)間10 min，再放入100 ℃水浴中煮沸5 min終止酶反應(yīng)，通過(guò)葡萄糖試劑盒測(cè)定OD505 nm值。

1.2.10 轉(zhuǎn)苷活性檢測(cè) 取1 mL粗酶液，加pH 7.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液配制50%葡萄糖濃度的反應(yīng)體系，45 ℃反應(yīng)48 h，煮沸10 min滅酶，0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析。

HPLC條件：色譜柱為Hypersil APS-2，流動(dòng)相為乙腈—水(體積比70∶30)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；漂移管溫度90 ℃；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

取3次平行試驗(yàn)的平均值，采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，優(yōu)化設(shè)計(jì)源自短小芽孢桿菌F1株β-葡萄糖苷酶基因序列，將原始基因序列優(yōu)化為適宜酵母表達(dá)的密碼子，以提高表達(dá)效率，優(yōu)化后的基因長(zhǎng)1 485 bp，編碼495個(gè)氨基酸。全基因序列由上海生工合成，合成基因被克隆到pUC57載體上，測(cè)序結(jié)果表明合成基因與設(shè)計(jì)的基因序列完全一致。

pUC57載體經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后，插入經(jīng)相同雙酶切的pPICZαA載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)Amp抗性篩選，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，電泳結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒與計(jì)算值相符，合成基因成功克隆至表達(dá)載體，重組的表達(dá)載體命名為pPICZαA-bglK。SacI酶切重組表達(dá)載體，酶切后線性化片段約5 078 bp(載體3 593 bp +目的基因1 485 bp)，電泳結(jié)果與理論值相符，純化回收線性化片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

M. DNA marker 1. 重組質(zhì)粒pPICZαA-bglK 2.SacI線性化pPICZαA-bglK

圖1SacI線性化重組質(zhì)粒pPICZαA-bglK

Figure 1 Linearization of recombinant pPICZαA-bglK bySacI

2.2 重組菌株的篩選和鑒定

線性化重組質(zhì)粒片段電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，在YPD抗性平板上共篩選獲得56個(gè)轉(zhuǎn)化子，挑選7個(gè)單克隆接種YPD液體培養(yǎng)基，提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)化子基因組擴(kuò)增箭頭所指為目的基因條帶，目的基因條帶1 485 bp和載體上序列488 bp的總和約1 973 bp，PCR鑒定結(jié)果表明bglK基因已插入畢赤酵母基因組中，泳道2～8均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子分別記為GS115/pPICZα-H1～H7。

M. DNA Marker 1. 陽(yáng)性對(duì)照 2～8. H1～H7轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增

圖2 PCR鑒定轉(zhuǎn)化子

Figure 2 PCR amplification of transformants

2.3 重組菌株的分泌表達(dá)

搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)72 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，由圖3可知，目標(biāo)蛋白理論大小約為57.5 kD，與泳道1 相比，泳道2～8明顯出現(xiàn)條帶。

M. 蛋白質(zhì)分子量對(duì)照 1. 陰性對(duì)照GS115/pPICZα 2～8. H1～H7轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清

圖3 畢赤酵母重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析

Figure 3 SDS-PAGE analysis of the expressed protein produced fromP.pastoris

2.4 Western Blotting分析

由圖4可知，在57.5 kD附近，2號(hào)泳道的一號(hào)菌株(GS115/pPICZα-H1)可見(jiàn)明顯的條帶信號(hào)，條帶大小與預(yù)期相符，表明短小芽孢桿菌F1株β-葡萄糖苷酶基因在

M. 蛋白質(zhì)分子量Marker 1. 陰性對(duì)照 2～8. 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子H1～H7發(fā)酵液上清

圖4 重組β-葡萄糖苷酶的Western Blotting鑒定

Figure 4 Western Blotting analysis of the recombinantβ-glucosidase

畢赤酵母中克隆并分泌表達(dá)成功。其他泳道未見(jiàn)顯色條帶可能是轉(zhuǎn)化子因整合酵母基因組位置不同導(dǎo)致蛋白表達(dá)上的差異，也可能是表達(dá)蛋白中His標(biāo)簽包埋程度不同導(dǎo)致顯色信號(hào)差異。

2.5 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 由圖5(a)可知，當(dāng)溫度為25～45 ℃時(shí)，相對(duì)酶活呈逐漸上升趨勢(shì)；當(dāng)溫度為45～60 ℃時(shí)，相對(duì)酶活逐漸下降，說(shuō)明重組酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃。由圖5(b)可知，重組酶在45 ℃時(shí)非常穩(wěn)定，50 ℃條件下酶的溫度半衰期為3 h，55 ℃下保溫1 h后酶活幾乎為零。不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶，其最適溫度分布在30～90 ℃[17]。

圖5 重組β-葡萄糖苷酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

2.5.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 由圖6(a)可知，伴隨pH值的改變，重組酶酶活出現(xiàn)明顯變化，pH處于5.0～6.0時(shí)，酶活較低；pH處于7.0～9.0時(shí)，相對(duì)酶活快速上升；pH處于9.0～10.0時(shí)，相對(duì)酶活快速降低；說(shuō)明重組酶最適pH值為9.0，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的多數(shù)β-葡萄糖苷酶的最適pH(3.5～6.5)一致。由圖6(b)可知，pH在7.0～9.0時(shí)，重組酶25 ℃條件下放置3 h，依然保持80%以上的酶活力，說(shuō)明重組酶在中性偏堿性條件下酶活力較高且比較穩(wěn)定。

2.5.3 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響 由圖7可知，測(cè)試的金屬離子未表現(xiàn)出對(duì)重組β-葡萄糖苷酶活力的促進(jìn)作用；在1，5 mmol/L的處理?xiàng)l件下，Na+、K+、Fe2+和Mg2+對(duì)重組β-葡萄糖苷酶活力的影響不大；Ca2+在5 mmol/L 時(shí)抑制了49%的酶活；Cu2+在1，5 mmol/L時(shí)分別抑制了77%，90%的酶活。不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶，金屬離子對(duì)酶活力的影響差異較大，但Cu2+對(duì)多數(shù)β-葡萄糖苷酶具有抑制作用[17]。

圖6 重組β-葡萄糖苷酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

圖7 金屬離子對(duì)重組β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.5.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù) 誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液上清酶活力為25.39 U/mL。將重組β-葡萄糖苷酶與不同濃度的pNPG進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同底物濃度的酶促反應(yīng)速度，通過(guò)雙倒數(shù)作圖法分析可知，酶促反應(yīng)具有典型米氏動(dòng)力學(xué)特性(圖8)，計(jì)算獲得重組酶的Km值為1.26 mmol/L，Vmax為32.15 μmol/(min·mg)。

2.5.5 底物特異性 由表1可知，重組β-葡萄糖苷酶對(duì)海藻糖、苦杏仁苷、七葉苷、水楊苷、柚皮苷等糖苷類物質(zhì)有一定的水解作用，對(duì)熊果糖、麥芽糖和蔗糖等無(wú)作用，對(duì)大豆苷其相對(duì)活力為pNPG的248%。大豆異黃酮在大豆中以糖苷和苷元兩種形式存在，其中以糖苷為主要存在形式，酶水解糖苷釋放出游離的大豆異黃酮苷元易被人體吸收[18-19]。此酶對(duì)大豆苷的水解反應(yīng)表現(xiàn)出高效催化作用，有望用于制備功能和保健食品。

圖8 重組β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)方程

Table 1 Hydrolysis of the recombinantβ-glucosidase on some natural glycosidic substrates

糖苷類物質(zhì)相對(duì)酶活/%糖苷類物質(zhì)相對(duì)酶活/%pNPGlu100D-海藻糖15七葉苷64熊果糖0苦杏仁苷53蔗糖0水楊苷65麥芽糖0大豆苷248纖維二糖82柚皮苷38

2.5.6 轉(zhuǎn)苷活性 由圖9可知，HPLC圖譜顯示酶催化反應(yīng)產(chǎn)物中，出現(xiàn)與龍膽二糖標(biāo)樣保留時(shí)間一致的峰，表明重組酶有轉(zhuǎn)苷活性，根據(jù)峰面積計(jì)算可知，龍膽二糖含量達(dá)34.25 g/L。

圖9 轉(zhuǎn)苷反應(yīng)產(chǎn)物HPLC分析圖譜

3 結(jié)論

試驗(yàn)將細(xì)菌Bacilluspumilus來(lái)源的β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明，短小芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶基因成功在畢赤酵母中克隆與分泌表達(dá)，方便蛋白質(zhì)純化，可進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)酵上清中重組β-葡萄糖苷酶酶活力達(dá)25.39 U/mL，重組β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度45 ℃，最適pH 9.0，在中性偏堿性條件下酶活力高且比較穩(wěn)定，1，5 mmol/L的Cu2+分別抑制77%，90%的酶活。重組β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆苷的高效水解和能夠酶促合成龍膽二糖，表明其具有較高的應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值，但仍需對(duì)大豆苷的水解條件及利用轉(zhuǎn)苷活性生產(chǎn)龍膽低聚糖的性質(zhì)和條件進(jìn)行優(yōu)化研究，為β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)的應(yīng)用及后續(xù)研究提供依據(jù)。