(內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，呼和浩特 010051)

高壓電暈電場(chǎng)是指能產(chǎn)生局部電暈放電的非均勻電場(chǎng)。對(duì)于多針陣列電極，由于針尖曲率半徑小，尖端電荷密度很大，當(dāng)電壓升高到一定值時(shí)，針尖處積累的大量電荷所產(chǎn)生的強(qiáng)電場(chǎng)使針尖周圍的空氣電離，從而產(chǎn)生局部放電，產(chǎn)生電暈[1-2]，這種裝置更適用于生物效應(yīng)和誘變機(jī)制研究。多針-板電極結(jié)構(gòu)的高壓電暈電場(chǎng)一般被應(yīng)用于生物物料干燥及靜電除塵[3-7]，還可用于環(huán)境污染物治理，降苯除硫[8]，以及農(nóng)產(chǎn)品分級(jí)[9]。近年來，這一技術(shù)被拓展應(yīng)運(yùn)于生物誘變及轉(zhuǎn)基因，發(fā)現(xiàn)電暈電場(chǎng)處理可提高愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，促進(jìn)愈傷組織形成[10]。利用高壓電暈電場(chǎng)誘變北蟲草菌分生孢子，可得到與原始菌株拮抗線明顯、電泳圖譜有明顯差異的誘變菌株[11]。可引發(fā)黃霉素產(chǎn)生菌、納豆芽孢桿菌和出芽短梗霉菌突變，獲得高效高產(chǎn)的突變菌[12-14]。利用高壓電暈電場(chǎng)處理大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，電暈電場(chǎng)對(duì)大腸桿菌的誘變具有損傷低、突變率高、突變譜寬的特點(diǎn)[15-16]。對(duì)棉花種子和小麥種子處理后發(fā)現(xiàn)，電暈放電形成的等離子體活性物質(zhì)對(duì)種子表面有化學(xué)刻蝕和物理刻蝕作用，使種子表面脊?fàn)钔黄饻p薄，并產(chǎn)生2微米級(jí)的刻蝕裂紋，這些蝕刻效果提高了種子的滲透性和吸水能力，可能促進(jìn)了小麥種子的萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)以及一些生理和代謝活動(dòng)[17-18]。研究表明，高壓電暈電場(chǎng)是一種具有裝置簡(jiǎn)單、生物效應(yīng)明顯、環(huán)境友好等很多優(yōu)點(diǎn)的新型物理誘變技術(shù)。目前，國(guó)家專利局已正式授權(quán)該技術(shù)實(shí)用新型專利[19]。

紫花苜蓿是多年生豆科開花植物，它具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、草質(zhì)優(yōu)良(收割的干草粗蛋白含量常達(dá)20%以上)、易于家畜消化等特點(diǎn)，是養(yǎng)殖業(yè)首選青飼料，在畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)耕作及生態(tài)環(huán)保等方面起著非常重要的作用[20]。但目前，天然草地的劣變導(dǎo)致飼草產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，草畜失衡的矛盾日益加劇，嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。為此誘變選育優(yōu)良紫花苜蓿牧草種質(zhì)資源是迫在眉睫的大事。而高壓電暈電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿生物效應(yīng)研究尚未見報(bào)道，利用高壓電暈電場(chǎng)生物技術(shù)進(jìn)行紫花苜蓿品種改良研究，培育有價(jià)值種質(zhì)資源，選育出高抗、優(yōu)質(zhì)新苜蓿品種，將會(huì)創(chuàng)造良好社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材 料

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供的紫花苜蓿種子。

1.2 儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)中，高壓電源輸出頻率為50 Hz，電壓為0～50 kV連續(xù)可調(diào)正弦交流電。高壓電極是由長(zhǎng)2 cm，針橫、縱向間距均為4 cm的針陣列組成，接地極為平面鋁板。電極尖端到接地極之間的距離(極距)為4 cm。

注：A為超凈工作臺(tái)；B為電極系統(tǒng)；C為控制單元；D為高壓絕緣卡；E為高壓電源。圖1 高壓電暈電場(chǎng)誘變裝置

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品準(zhǔn)備

對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行選種，篩除不良籽粒，得到一致性較好的飽滿籽粒198 g，蒸餾水沖洗3次去除表面雜質(zhì)及浮土，均勻擺放在直徑為9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿6 g，共33個(gè)培養(yǎng)皿，用萬分之一電子天平進(jìn)行精確稱量并標(biāo)記。

1.3.2高壓電暈電場(chǎng)處理

采用電壓為0(ck對(duì)照組)、4 kV、8 kV、12 kV、16 kV、19 kV針-板電暈電場(chǎng)分別對(duì)上述準(zhǔn)備好的紫花苜蓿樣品進(jìn)行處理，處理時(shí)間為30 min，處理時(shí)每個(gè)劑量分成2組，每組3次重復(fù)，其中一組用厚度為1 mm的聚丙烯培養(yǎng)皿蓋電介質(zhì)阻擋放電，另一組不加培養(yǎng)皿蓋。

1.3.3紫花苜蓿種子電導(dǎo)率的測(cè)定

在上述處理后的33個(gè)培養(yǎng)皿種子中同時(shí)加入去離子水40 mL，浸種20 h后用DDSJ-318型電導(dǎo)儀測(cè)浸出液電導(dǎo)率。

1.3.4紫花苜蓿種子吸水率的測(cè)定

上述浸種20 h后的紫花苜蓿吸脹種子用濾紙吸干表面水分后稱量吸水后種子的質(zhì)量。吸水率用如下公式計(jì)算。

吸水率(%)=[(吸水后種子質(zhì)量-吸水前種子的質(zhì)量)/吸水前種子的質(zhì)量]×100%。

1.3.5苗高、鮮重的測(cè)量

從每個(gè)皿中隨機(jī)挑取100粒種子擺放在鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中同置于光照培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)、5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。在出芽后，給光照培養(yǎng)箱加140 lx光照條件，連續(xù)光照14 h，黑暗10 h進(jìn)行培養(yǎng)，10 d后每皿隨機(jī)挑取10株紫花苜蓿幼苗測(cè)量鮮重和苗高。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子浸出液電導(dǎo)率的影響

經(jīng)高壓電暈電場(chǎng)處理后，紫花苜蓿種子浸出液電導(dǎo)率如圖2所示。

圖2 電導(dǎo)率變化

由圖2可知，用電壓為4 kV、8 kV、16 kV、20 kV高壓電暈電場(chǎng)處理30 min后無論是否用培養(yǎng)皿蓋阻擋放電，紫花苜蓿種子浸出液的電導(dǎo)率較對(duì)照組都有一定提高，電壓為4 kV、8 kV、16 kV時(shí)，未經(jīng)培養(yǎng)皿蓋阻擋放電的種子浸出液的電導(dǎo)率均高于培養(yǎng)皿蓋阻擋后的電導(dǎo)率。電壓為20 kV時(shí)，經(jīng)培養(yǎng)皿蓋阻擋放電后的種子浸出液的電導(dǎo)率高于未阻擋的電導(dǎo)率。經(jīng)電壓為12 kV的高壓電暈電場(chǎng)處理后，無論培養(yǎng)皿蓋阻擋與否，紫花苜蓿種子浸出液的電導(dǎo)率較對(duì)照組都低。從變化趨勢(shì)看，紫花苜蓿種子浸出液的電導(dǎo)率隨電壓升高呈先升后降再升再降的非單調(diào)震蕩型曲線。

2.2 高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子吸水率的影響

經(jīng)高壓電暈電場(chǎng)處理后，紫花苜蓿種子吸水率如圖3所示。由圖3(a)可知，8 kV加蓋阻擋組和16 kV不阻擋組，種子的吸水率比對(duì)照有所下降，但下降不明顯，其他各組的種子吸水率與對(duì)照組相比都有所升高。這說明，經(jīng)高壓電暈電場(chǎng)處理后，可改善種子的吸水率。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)各組種子電暈電場(chǎng)處理后，浸種時(shí)在培養(yǎng)皿中加入40 mL去離子水，電場(chǎng)處理時(shí)不加蓋阻擋的種子只有很少幾粒漂浮在水面，加蓋阻擋時(shí)，漂浮在水面的種子有所增加，但不足6 g種子的1/3，而對(duì)照組的種子則有一多半漂浮在水面上。圖3(b)所示照片左為對(duì)照組(0 kV)，中為19 kV加培養(yǎng)皿蓋阻擋放電組，右為19 kV不加培養(yǎng)皿蓋組。其它場(chǎng)強(qiáng)的電暈電場(chǎng)處理組也發(fā)現(xiàn)類似情況。

圖3(a)吸水率變化

圖3(b)種子浸泡

2.3 高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率的影響

經(jīng)高壓電暈電場(chǎng)處理后，紫花苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別如圖4、圖5所示。由圖可知，在高壓電暈電場(chǎng)處理時(shí)，有沒有培養(yǎng)皿蓋阻擋放電對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有截然相反的影響。當(dāng)沒有培養(yǎng)皿蓋阻擋放電時(shí)，在低劑量即電壓為4 kV、8 kV時(shí)，高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽有刺激效應(yīng)，而經(jīng)培養(yǎng)皿蓋阻擋放電后，高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽卻為抑制效應(yīng)。隨著電壓進(jìn)一步升高，當(dāng)沒有培養(yǎng)皿蓋阻擋放電時(shí)，高壓電暈電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽全部表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，并隨電壓升高，抑制效應(yīng)越明顯；而經(jīng)培養(yǎng)皿蓋阻擋放電后，高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽卻變?yōu)榇碳ば?yīng)，只有在16 kV時(shí)是抑制效應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)皿蓋阻擋放電后，紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率整體呈典型的均勻電場(chǎng)生物效應(yīng)曲線即非單調(diào)震蕩型曲線。

2.4 高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿苗高和鮮重的影響

經(jīng)高壓電暈電場(chǎng)處理后，紫花苜蓿苗高和鮮重如圖6、圖7所示。從圖6可以看出，高壓電暈電場(chǎng)處理后，紫花苜蓿的苗高與對(duì)照相比都有大幅度提高，總體呈先升后降趨勢(shì)，低劑量處理無論是否有介質(zhì)阻擋放電，對(duì)苗高影響較大，隨著劑量升高，苗高有一定降低，但均大幅度高于對(duì)照。從圖7可知，除4 kV加培養(yǎng)皿蓋阻擋放電組和12 kV無阻擋組的鮮重低于對(duì)照組外，其余各處理組的鮮重與對(duì)照組相比都有一定提高。鮮重的變化趨勢(shì)與發(fā)芽勢(shì)發(fā)芽率的變化趨勢(shì)基本相同。

圖4 發(fā)芽勢(shì)變化

圖5 發(fā)芽率變化

圖6 苗高變化

圖7 鮮重變化

3 討 論

由氣體放電理論可知，當(dāng)高壓電暈電場(chǎng)處理紫花苜蓿種子時(shí)，加培養(yǎng)皿蓋阻擋放電，可導(dǎo)致種子接受的總場(chǎng)強(qiáng)迅速減小。電場(chǎng)強(qiáng)度的減小導(dǎo)致微放電的減少和擊穿電壓升高[21]。且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，介質(zhì)阻擋層可以有效地降低電場(chǎng)的非均勻度[22]?？傊?，在高壓電暈電場(chǎng)處理紫花苜蓿種子時(shí)，加培養(yǎng)皿蓋阻擋放電，可以非常有效的減小離子風(fēng)對(duì)的物理刻蝕程度，同時(shí)降低紫花苜蓿種子的接受的場(chǎng)強(qiáng)，并使紫花苜蓿種子接受的輻射電場(chǎng)更趨均勻，等離子體活性物質(zhì)的濃度更小使化學(xué)刻蝕紫花苜蓿種子程度減弱。

非均勻電場(chǎng)對(duì)處在其中的生物體有一系列作用[23]，如可對(duì)生物膜產(chǎn)生影響，改變酶活性，促進(jìn)愈傷組織增殖分化，影響光合器官和功能等。高壓電暈電場(chǎng)的另一個(gè)作用就是非均勻電暈放電，電暈放電可以使空氣電離產(chǎn)生較多低溫等離子體，并在電場(chǎng)作用下形成離子風(fēng)，特別是同時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，具有較高的催化活性和生物效應(yīng)[24-25]，而且電暈放電還可產(chǎn)生水煤氣、CO2、CO和含有-C(CH3)3-部分的分子，可能通過氧化種皮的有機(jī)組分對(duì)種子表面形成化學(xué)刻蝕[17]，這種物理和化學(xué)刻蝕可使紫花苜蓿種子表皮減薄，并產(chǎn)生刻蝕裂紋。

紫花苜蓿種子表面是疏水的，由浸種實(shí)驗(yàn)圖3(b)可以看出，未經(jīng)處理的對(duì)照組種子更多漂浮在水面上。高壓電暈電場(chǎng)處理后，種皮的高度致密的表面紋理也可能更脆弱，因此更容易開裂，這有利于更有效吸收水和營(yíng)養(yǎng)物[26]，種子表面的物理化學(xué)刻蝕使其更親水，這有利于種子潤(rùn)濕和滲透到種子中從而促進(jìn)發(fā)芽過程[27]。種子的親水性可以通過吸水率測(cè)量來證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中，只有8 kV加蓋阻擋組種子的吸水率比對(duì)照有所下降，但下降不明顯，是否是刻蝕程度不足，還需進(jìn)一步研究。其他各處理組的種子吸水率與對(duì)照組相比都有所升高。在圖3(b)中可以看到，大部分未經(jīng)處理(對(duì)照組ck)的種子漂浮在水面上，而高壓電暈電場(chǎng)處理的種子由于不同的吸水能力而下沉到培養(yǎng)皿的底部。本研究結(jié)果與Wang等[17]的結(jié)果一致。電暈放電等離子體物理化學(xué)刻蝕，可使種皮減薄并產(chǎn)生裂紋，提高吸水率的同時(shí)，也增加了種子中電解液的外滲。從圖2中可以看出，除12 kV的高壓電暈電場(chǎng)處理組外，其他4組無論是否有培養(yǎng)皿蓋阻擋放電，其浸出液的電導(dǎo)率都較對(duì)照組高。從圖4、圖5、圖7的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和鮮重結(jié)果可知，當(dāng)沒有培養(yǎng)皿阻擋放電，在低劑量4 kV和8 kV時(shí)，高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿的發(fā)芽有刺激效應(yīng)，促進(jìn)紫花苜蓿生長(zhǎng)。當(dāng)電壓繼續(xù)增大時(shí)，發(fā)芽表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，也對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)量有一定抑制。許瀟等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)極距為d=30 mm時(shí)，多針電極起暈電壓<6 kV，多針電極的擊穿電壓出現(xiàn)在19 kV左右[28]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的極距為d=40 mm，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，擊穿電壓為19 kV，起暈電壓約為6 kV。這說明，4 kV和8 kV在產(chǎn)生電暈放電的臨界電壓附近，此時(shí)，等離子體濃度較低，電壓小，等離子體加速后能量也很小，對(duì)種子的物理化學(xué)刻蝕適當(dāng)，所以，此劑量下對(duì)發(fā)芽率有刺激效應(yīng)。隨著電壓升高，場(chǎng)強(qiáng)增加，放電等離子體濃度增大，離子風(fēng)速度加大，對(duì)紫花苜蓿種子的物理化學(xué)刻蝕程度加深，多種因素相加對(duì)紫花苜蓿的損傷程度加大，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為對(duì)發(fā)芽抑制效應(yīng)。對(duì)于加培養(yǎng)皿蓋阻擋放電組來說，在高電壓時(shí)，為刺激效應(yīng)，主要原因是培養(yǎng)皿蓋阻擋放電作用使起暈電壓和擊穿電壓升高，且非常有效的減小離子風(fēng)對(duì)種子的物理刻蝕程度，同時(shí)降低紫花苜蓿種子的接受的場(chǎng)強(qiáng)，并使紫花苜蓿種子接受的輻射電場(chǎng)更趨均勻，等離子體活性物質(zhì)的濃度更小使化學(xué)刻蝕紫花苜蓿種子程度減弱。介質(zhì)阻擋作用使高電壓下這幾種因素疊加后對(duì)紫花苜蓿的作用適當(dāng)，所以發(fā)芽表現(xiàn)為刺激效應(yīng)，促進(jìn)了紫花苜蓿的生長(zhǎng)。

有無培養(yǎng)皿蓋阻擋放電對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有截然相反的影響，整個(gè)變化趨勢(shì)呈非單調(diào)震蕩型曲線。考慮可能是由于細(xì)胞受到不同的高壓非均勻電場(chǎng)的刺激后損傷修復(fù)程度不同，其中高壓電場(chǎng)的電穿孔損傷作用不可忽視。當(dāng)外加高壓電場(chǎng)后，細(xì)胞膜各點(diǎn)受到電場(chǎng)力的作用，細(xì)胞膜上的分子或離子就會(huì)發(fā)生碰撞、吸引、排斥等一系列運(yùn)動(dòng)，加之離子風(fēng)的物理化學(xué)刻蝕，導(dǎo)致細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞電穿孔使膜內(nèi)分子間相互作用力的平衡遭到破壞。白愛枝等研究表明，經(jīng)高壓電場(chǎng)處理后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁損傷嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)容物溢出[29]。當(dāng)電壓達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)會(huì)對(duì)發(fā)芽產(chǎn)生抑制作用，而高壓電暈電場(chǎng)處理對(duì)種皮有刻蝕作用會(huì)促進(jìn)發(fā)芽過程，與高壓非均勻電場(chǎng)其他效應(yīng)共同作用使得種子萌發(fā)分別呈刺激或抑制作用，另外此過程中伴隨著種子的自我損傷修復(fù)過程，導(dǎo)致整個(gè)變化趨勢(shì)呈非單調(diào)震蕩型曲線。

從圖6可知高壓電暈電場(chǎng)處理后，紫花苜蓿的苗高與對(duì)照相比都有大幅度提高，說明高壓電暈電場(chǎng)處理，無論是否抑制其吸水率或發(fā)芽率，均對(duì)已萌發(fā)的幼苗苗高有促進(jìn)作用。是因?yàn)橐欢◤?qiáng)度的電場(chǎng)處理可使自由基含量提高，從而使生物膜透性增加，酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而使種子提早萌發(fā)，生長(zhǎng)加快[30]。種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多因素調(diào)控，其生理活動(dòng)過程離不開酶的參與[31]。研究表明，電場(chǎng)處理可提高酶活性，促進(jìn)種子的呼吸作用，為種子萌發(fā)提供必要的物質(zhì)和能量保障，加速新細(xì)胞形成，促進(jìn)根芽分化和生長(zhǎng)，這也是種子在電場(chǎng)處理后萌發(fā)活力提高的內(nèi)在原因[32-35]。前人研究認(rèn)為，酶活性的增強(qiáng)與電場(chǎng)處理誘導(dǎo)酶的合成有關(guān)，其機(jī)制可能是電場(chǎng)作用引起蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)等極性分子和離子的定向排列，從而引起含金屬離子酶的構(gòu)象發(fā)生變化，對(duì)酶提前進(jìn)行激活作用[33-34,36]，進(jìn)而對(duì)高壓電場(chǎng)處理后的幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生了促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

1)高壓電暈電場(chǎng)處理紫花苜蓿種子時(shí)，無論是否有培養(yǎng)皿蓋阻擋放電，可改善紫花苜蓿種子的親水性，使種子吸水后沉入培養(yǎng)皿底部，無培養(yǎng)皿蓋阻擋放電組改善程度更大，只有8 kV加蓋阻擋組種子的吸水率比對(duì)照有所下降。

2)在高壓電暈電場(chǎng)處理紫花苜蓿種子時(shí)，加培養(yǎng)皿蓋阻擋放電，可以非常有效的減小離子風(fēng)對(duì)種子的物理刻蝕程度，同時(shí)降低紫花苜蓿種子的接受的場(chǎng)強(qiáng)，并使紫花苜蓿種子接受的輻射電場(chǎng)更趨均勻，等離子體活性物質(zhì)的濃度更小，使化學(xué)刻蝕紫花苜蓿種子程度減弱。