唐銘袈，楊燕，王宇，劉忞之，王偉

楊梅糖基轉(zhuǎn)移酶UGT71AN1的克隆與功能鑒定

唐銘袈，楊燕，王宇，劉忞之，王偉

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗室/國家衛(wèi)生健康委員會天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗室

從楊梅中分離鑒定糖基轉(zhuǎn)移酶基因，進(jìn)行其生物催化特性研究并應(yīng)用于天然產(chǎn)物的糖基化修飾。

利用轉(zhuǎn)錄組測序分析從楊梅葉片中獲得編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的 Unigenes，再結(jié)合 RT-PCR 方法克隆獲得該目標(biāo)基因的 cDNA，然后構(gòu)建表達(dá)載體并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，利用體外的酶促反應(yīng)進(jìn)行其生物催化活性研究。

從楊梅葉片中提取總 RNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組高通量測序和生物信息學(xué)分析獲得編碼糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT71AN1 基因；利用大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)并純化獲得融合蛋白，該酶能催化槲皮素、山奈酚、紫鉚因、棕矢車菊素、原花青素和圣草酚等黃酮類化合物合成相應(yīng)的葡萄糖苷；利用質(zhì)譜和 NMR 對合成的糖苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷鍵結(jié)構(gòu)。

克隆獲得一個具有催化黃酮類化合物形成葡萄糖苷的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，可利用酶促或全細(xì)胞生物催化進(jìn)行黃酮類天然產(chǎn)物的糖基化結(jié)構(gòu)修飾。

糖基轉(zhuǎn)移酶類； 楊梅屬； 生物催化； 黃酮糖苷

糖基化反應(yīng)是天然產(chǎn)物生物合成過程中的一個重要修飾反應(yīng)，結(jié)合羥基化、?；图谆磻?yīng)形成植物次生代謝產(chǎn)物的多樣性和復(fù)雜性。糖基化修飾能改善天然藥物的成藥性，尤其能增強(qiáng)其水溶性和穩(wěn)定性。糖苷的形成是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化活化的核苷二磷酸單糖到不同的苷元，糖受體包括酚類、萜類、氰醇和生物堿在內(nèi)所有類型的次生代謝產(chǎn)物[1-3]。雖然化學(xué)合成法可實(shí)現(xiàn)不同苷元受體的糖基化，但化學(xué)反應(yīng)條件通常較為苛刻，需要保護(hù)和脫保護(hù)等多步反應(yīng)，很難實(shí)現(xiàn)特定位置的糖基化修飾。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，近年來植物轉(zhuǎn)錄組測序得到快速發(fā)展，極大地促進(jìn)植物功能基因的克隆和功能鑒定。目前已有很多糖基轉(zhuǎn)移酶得以功能鑒定，并建立了酶促反應(yīng)和全細(xì)胞水平的生物催化體系并用于天然藥物的結(jié)構(gòu)修飾研究[4-7]。

糖基轉(zhuǎn)移酶具有良好的區(qū)域或位置選擇性（regio-selectivity）和立體選擇性（stereo- selectivity）[8-9]，這一催化特性是實(shí)現(xiàn)特定位置的糖基化修飾的優(yōu)勢，但對含有多個可修飾位點(diǎn)的天然藥物（尤其是含有多羥基的黃酮類化合物）實(shí)現(xiàn)不同羥基多樣化的糖基化修飾而言也存在很大的不足，針對每個糖基化位點(diǎn)需要具有特定區(qū)域選擇性的糖基轉(zhuǎn)移酶。不僅如此，即使具有相同位置選擇性的糖基轉(zhuǎn)移酶，也呈現(xiàn)出不同的催化活性[10]。因此，為促進(jìn)天然藥物的糖基化修飾研究，需要分離鑒定功能多樣的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

楊梅（）具有很高的藥用和食用價值，具有多種活性化合物如黃酮、酚類、有機(jī)酸、三萜等[11]，黃酮類化合物主要有槲皮素、楊梅素、山奈酚和花青素等[11]，已有的研究結(jié)果表明楊梅提取物的生物活性具有多種臨床應(yīng)用價值，如抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗炎和抗高血脂[12]。楊梅中黃酮類化合物活性成分雖然具有多種藥理活性[13-14]，但開發(fā)成藥時受限于溶解度低，極大地阻礙了其制劑的開發(fā)與應(yīng)用。黃酮類化合物在楊梅中大部分以糖苷形式存在，如楊梅素-3-O-鼠李糖苷（楊梅苷）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香苷（蘆丁）等[11]，而對于不同糖苷的化學(xué)提取純化步驟繁瑣，反應(yīng)條件劇烈，產(chǎn)物回收率低。為利用生物催化技術(shù)進(jìn)行楊梅中糖苷類化合物的合成，需要從楊梅中挖掘具有功能的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但到目前為止還未有從楊梅中鑒定到有功能的糖基轉(zhuǎn)移酶的研究報道。本研究利用轉(zhuǎn)錄組分析從楊梅中獲得編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的 Unigene，然后在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)并對其催化活性進(jìn)行功能鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌DH10B 用于質(zhì)粒載體的構(gòu)建和制備；（DE3）用作融合蛋白的表達(dá)宿主。

1.1.2 儀器和試劑 Trizol 試劑和一步法逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR 試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 楊梅葉片 RNA 的提取及 cDNA 合成 取–80 ℃冰箱冷藏的楊梅葉片經(jīng)液氮速凍充分研磨后，按照 Trizol 試劑操作手冊方法提取總 RNA。測定總 RNA 的濃度和純度，260/280介于 1.8 ~ 2.2，說明提取的 RNA 無蛋白和 DNA 污染。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析，參照一步法逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR 試劑盒說明書合成 cDNA，用作糖基轉(zhuǎn)移酶的候選基因克隆模板。

1.2.2 楊梅中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆 根據(jù)楊梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果，選取候選糖基轉(zhuǎn)移酶基因 Unigene 設(shè)計特異性引物用于候選糖基轉(zhuǎn)移酶全長基因 cDNA 的克隆，引物設(shè)計如表 1 所示。用引物 UGT71AN1-5 進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，RT-PCR 反應(yīng)體系含有KAPA HIFI HotstartReady Mix 溶液 25 μl，引物 UGT71AN1-1 和UGT71AN1-4（10 μmol/L）各 2 μl，cDNA 模板1 μl，用 ddH2O 補(bǔ)足至 50 μl。反應(yīng)程序為預(yù)變性 94 ℃ 5 min；變性 94 ℃ 50 s；退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min 30 s，運(yùn)行 30 個循環(huán)；延伸 72 ℃ 10 min。再以第一輪 PCR 產(chǎn)物為模板，使用引物UGT71AN1-2 和 UGT71AN1-3 進(jìn)行第 2 輪 PCR擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的 DNA 片段亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體 pTWIN1B（在表達(dá)載體 pTWIN1 基礎(chǔ)上進(jìn)行多克隆位點(diǎn)的修飾）[10]，利用菌落 PCR 方法篩選正確的陽性克隆進(jìn)行 DNA 測序驗證。

1.2.3 楊梅中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI 分析工具 BLASTP 進(jìn)行所克隆編碼基因衍生的氨基酸序列一致性分析，下載相關(guān)的具有同源性和功能鑒定的糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列，蛋白序列由 Clustal W 比對，使用 MEGA 6.0 軟件構(gòu)建 Neighbor-joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶的功能機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1.2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的重組表達(dá)和純化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTWIN1B-UGT71AN1 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Transetta（DE3）中，空載體 pTWIN1B 為對照。將含重組表達(dá)載體和空載體的Transetta（DE3）菌株于 37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)至600= 1.0，再按照 1% 的接種量將菌液接種至 100 ml 的 LB 培養(yǎng)基中（含 50 mg/L 的氨芐青霉素），培養(yǎng)至600= 0.6 后，加入終濃度為 0.55 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖（IPTG），在 16 ℃、165 r/min的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 h。隨后以 8000 ×離心 10 min，收集菌體，并用 Buffer B1（20 mmol/L Na-HEPES，pH 8.5）漂洗兩次，再次充分混懸菌體。將菌體混懸液使用高壓均質(zhì)機(jī)破碎 10 min，然后 12 500 ×離心 40 min，上清液即為粗酶液。

利用 IMPACTTM-TWIN 蛋白純化系統(tǒng)對粗酶液進(jìn)行純化。將粗酶液上樣于柱體積為15 ml 的幾丁質(zhì)柱進(jìn)行親和層析純化，由于內(nèi)含肽位于目的蛋白的 N-端，通過溫度和 pH 值（pH 6 ~ 7）改變誘導(dǎo)內(nèi)含肽的裂解，內(nèi)含肽與目的蛋白之間的肽鍵被切割，目的蛋白得以分離釋放。用 400 ml Buffer B1 清洗柱體，再用 3 倍柱體積的 Buffer B2（20 mmol/L Na-HEPES pH 6.5）沖洗柱體，溫室放置 3 d。隨后用超濾管脫鹽濃縮，通過 SDS-PAGE 鑒定純化蛋白。

1.2.5 糖基轉(zhuǎn)移酶的活性篩選 利用純化的融合蛋白 UGT71AN1 進(jìn)行酶促反應(yīng)，制備黃酮類糖苷的反應(yīng)體系，包含 1 mmol/L 的底物、2 mmol/L UDP-Glc、1 mmol/L UGT71AN1 純酶。酶促反應(yīng)在 Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 200 μl。30 ℃、220 r/min 搖床振蕩反應(yīng) 12 h 后，加入 400 μl 的冰甲醇終止反應(yīng)，充分混勻后離心取上清過 0.22 μm 濾膜，進(jìn)而利用反相 HPLC 分析酶促反應(yīng)產(chǎn)物，再用 HPLC分離制備少量產(chǎn)物進(jìn)行 HR-ESI-MS 等譜學(xué)測定分析以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

表 1 本研究中涉及到的 PCR 引物

1.2.6 糖基轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌工程菌的全細(xì)胞生物催化 為建立全細(xì)胞生物催化合成糖苷的催化體系，需要在工程菌DE3/pTWIN1B-中繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有磷酸葡萄糖變位酶（phosphoglucomutase，PGM）和葡萄糖-1-磷酸焦磷酸化酶（glucose-1-phosphate uridyltransferase，galU）基因的質(zhì)粒 pSLB208-Pgm-T7-GalU[10]，這兩個酶是糖基供體 UDP-葡萄糖合成關(guān)鍵酶。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆，轉(zhuǎn)接到 30 ml LB 培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)抗性的抗生素，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng) 6 h，600= 1.0；按照 1% 的接種量接種到100 ml 的 LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)2 ~ 3 h 后，600= 0.6 時加入 IPTG（200 mg/ml）65 μl，16 ℃ 165 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 h，離心收集菌體，漂洗2 次，加入到改良后的 M9 培養(yǎng)基（含 10% 的葡萄糖 pH 7.0）中，調(diào)節(jié)600= 6.0；分裝菌液到反應(yīng)容器中，向菌液中加入工作濃度為1 mmol/L 的槲皮素（母液濃度為 100 mmol/L，溶于 DMSO 中），每管 1 ml，每組為 3 個平行反應(yīng)。30 ℃186 r/min 反應(yīng)，分別于 0、2、4、6、10、12、24、36、48 h 時取樣，測定600值，將反應(yīng)體系冷凍干燥，加入 1 ml 的 80% 甲醇水溶液超聲30 min，提取反應(yīng)產(chǎn)物，12 000 r/min 離心 15 min，取上清液經(jīng) 0.22 μm 的濾膜過濾，進(jìn)行 HPLC 分析。產(chǎn)物以外標(biāo)法定量，計算各時間點(diǎn)產(chǎn)物的收率。

2 結(jié)果

2.1 楊梅中糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT71AN1 的克隆

本研究首次對楊梅葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，并且基于楊梅葉片的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，共發(fā)現(xiàn) 11 個功能注釋為糖基轉(zhuǎn)移酶的 Unigenes，其中 Unigene（c35900_g1_i1）被注釋為黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶，然后采用 RT-PCR 方法直接克隆具有完整 ORF 的 cDNA，長度為 1437 bp，編碼 478 個氨基酸殘基，已在 GenBank 注冊（MK722191）并由碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy）（http://www.cazy.org/）對其功能注釋分類為 UGT71AN1 亞家族。利用 NCBI 分析工具 BLASTP 進(jìn)行分析，該基因編碼的氨基酸序列與 UGT71 家族的糖基轉(zhuǎn)移酶具有較高的一致性（55.18% ~ 68.5%）；UGT71AN1 C-端具有典型的糖基轉(zhuǎn)移酶家族保守的結(jié)構(gòu)域（plant secondary product glycosyltransferases，PSPG），PSPG 結(jié)構(gòu)域是糖基供體與目的蛋白發(fā)生作用的主要作用區(qū)域[15]，圖 1 是針對下文系統(tǒng)進(jìn)化分析中 32 個糖基轉(zhuǎn)移酶保守的 PSPG 結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基的統(tǒng)計分析。

2.2 楊梅中糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT71AN1 的生物信息學(xué)分析

糖基轉(zhuǎn)移酶是一個多成員的基因家族，根據(jù)其氨基酸序列的同源性、催化底物性質(zhì)、反應(yīng)機(jī)制和三維結(jié)構(gòu)，糖基轉(zhuǎn)移酶被分為 106 個家族（CAZY），從CAZY 給出的信息得知 UGT71 家族與 GT8 家族具有較近的親緣關(guān)系，而 GT8 家族的底物譜包括生物激素類、黃酮類、萜類等，推測 UGT71 家族的底物譜也可能包含這些底物。UGT71AN1 與來自其他植物 UGTs 的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖 2 所示，UGT71AN1 基因與 UGT71 家族中的糖基轉(zhuǎn)移酶OAP09182（UGT71C1）、NP_001280899（UGT71K1）、D3UAG2（UGT71K2）等相似度較高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚為一大類，歸屬為能催化黃酮多位點(diǎn)的糖基轉(zhuǎn)移酶，如NP_001280899（UGT71K1）和 D3UAG2（UGT71K2）能分別催化根皮素-2'-O-羥基和黃酮-4'-O-羥基的糖基化[16-17]，表明 UGT71 家族參與多種類型的次生代謝產(chǎn)物的糖苷化反應(yīng)，并且催化底物廣泛。UGT71AN1 作為 UGT71 家族的單獨(dú)分支，也可能參與楊梅中多種活性成分的糖基化反應(yīng)。

圖 1 32 個糖基轉(zhuǎn)移酶 C-端保守 PSPG 結(jié)構(gòu)域

Figure 1 Weblogo of conserved PSPG motifs identified in the 32 glucosyltransferases

Figure 2 The phylogenetic tree analysis of UGT71AN1 and other plant UGT proteins by Neighbor-Joining method on MEGA 6.0 [GenBank Accession numbers of the GTs:(AFI71901, AFI71902),(OAP13716, NP_193283, NP_188793, OAP09182),(PIN26436),(ACS15351),(NP_001105886),(XP_020222524),(AHJ80981),(XP_003543752),(EXB94563),(NP_001312241),(ABL85474),(Q767C8),(B2NID7),(AHL68667),(C3W7B0),(I1L3T1),(A0A0A1HA03), Fragaria x ananassa (Q66PF4),(AAS55083),(AIF79773),(AJT58578),(NP_001280899, RXH90237),(D3UAG2),(AYR16626),(D3UAG1),(ACB88210),(MK722191)]

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT71AN1 的異源表達(dá)和純化

糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT71AN1 為非分泌蛋白，利用大腸桿菌進(jìn)行異源融合表達(dá)，經(jīng)高壓破碎菌體后，細(xì)胞內(nèi)的蛋白釋放出來，SDS-PAGE 分析結(jié)果如圖 3 所示，與對照相比，UGT71AN1 重組菌體破碎上清液在 70 ~ 100 kD 處有明顯的增強(qiáng)表達(dá)的蛋白條帶，說明楊梅糖基轉(zhuǎn)移酶基因在Transetta（DE3）表達(dá)宿主中可溶性的融合表達(dá)。經(jīng)過親和層析純化，大小約為 20 kD 的內(nèi)含肽被切割掉，洗脫純化后的 UGT71AN1 蛋白條帶大小與預(yù)期相符，約 55 kD 左右，純度達(dá)到 90% 以上。經(jīng)超濾脫鹽，獲得 5 ml 純酶，質(zhì)量濃度為 0.4 mg/ml。將純化后的酶與 40% 甘油以1:1 的比例保存于–80 ℃冰箱備用。

Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of expressed UGT71AN1

2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶的活性篩選

不同糖基轉(zhuǎn)移酶識別的受體各有不同，N-端結(jié)構(gòu)域是主要的識別部位[18]，根據(jù)碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫的功能注釋選取以黃酮類化合物為受體和 UDP-葡萄糖為供體，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，酶促催化合成槲皮素、山奈酚、(S)-圣草酚、異甘草素、紫鉚因和棕矢車菊素形成相應(yīng)的糖苷類化合物（圖 4A）。通過 HPLC 檢測反應(yīng)產(chǎn)物，利用反應(yīng)底物和生成的糖苷產(chǎn)物的色譜積分初步計算相對活性，對棕矢車菊素具有最好的催化活性，其次是山奈酚、槲皮素、異甘草素、紫鉚因和 (S)-圣草酚（圖 4B）；再結(jié)合陽離子掃描質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品對比確認(rèn)糖苷產(chǎn)物。

對槲皮素糖苷進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定：首先利用 HPLC 進(jìn)行分離純化，如圖 5A 所示，UGT71AN1 反應(yīng)組中底物槲皮素保留時間為 20.23 min，在保留時間為 11.88 min處有明顯單一產(chǎn)物峰，質(zhì)譜 HR-ESI-MS 陽離子模式掃描結(jié)果 m/z 465.39 [M+H]+，487.47 [M+Na]+（圖 5B）；質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 UGT71AN1 催化槲皮素形成了槲皮素-3'- O-葡萄糖苷（分子式為 C21H20O12），并經(jīng)1H-NMR和13C-NMR 手段鑒定結(jié)構(gòu)。

1H-NMR（500 MHz，DMSO-d）δ = 7.62（m，1H，H-2'），7.61（m，1H，H-6'），6.88（m，1H，H-5'），6.45（d，= 2.0 Hz，1H，H-8），6.24（d，= 2.0 Hz，1H，H-6），5.50（d，= 7.2 Hz，1H，H-1''），3.63（m，2H，H-5''，H-6a''），3.47-3.26（m，3H，H-2"，H-3"，H-4''），3.12（m，1H，H-6b"）。

13C-NMR（125 MHz，DMSO-d）δ = 157.3（C-2），134.2（C-3），178.4（C-4），157.1（C-5），99.6（C-6），165.1（C-7），93.2（C-8），162.2（C-9），104.9（C-10），122.6（C-1'），116.2（C-2'），145.8（C-3'），149.4（C-4'），117.1（C-5'），122.1（C-6'），101.7（C-1''），73.3（C-2''），75.8（C-3''），70.9（C-4''），77.4（C-5''），61.9（C-6''）。

2.5 槲皮素-3'-O-葡萄糖苷的全細(xì)胞催化合成

以槲皮素為受體底物，考察在 M9 培養(yǎng)基（含 10% 葡萄糖）中工程菌催化其合成槲皮素-3'- O-葡萄糖苷的生物催化動力學(xué)，如圖 6 所示。調(diào)整工程菌的初始菌密度600值為 6.0，于 0 h 添加 1 mmol/L 槲皮素，產(chǎn)物在 12 h 內(nèi)迅速增加，而后12 ~ 72 h 基本保持平衡，工程菌在0 ~ 10 h 依然保持生長活性，在 48 h 時達(dá)到生長頂峰，因長時間培養(yǎng)過程中營養(yǎng)的耗盡，48 h 后呈現(xiàn)下降趨勢。

3 討論

天然產(chǎn)物具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓以及增強(qiáng)免疫等生物活性。但也存在生物活性不佳、溶解度低、穩(wěn)定性差或不良反應(yīng)等因素使得天然產(chǎn)物的新藥研發(fā)難度增加并限制了其臨床應(yīng)用。糖基化修飾能改變這些化學(xué)分子的活性、水溶性、穩(wěn)定性，另外還能降低或消除有毒物質(zhì)的毒性[1, 4, 19]。糖基轉(zhuǎn)移酶是實(shí)現(xiàn)糖基化修飾的一類重要催化反應(yīng)，目前不僅已有功能多樣的糖基轉(zhuǎn)移酶被克隆和功能鑒定，還有酶促水平和全細(xì)胞的生物催化技術(shù)得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用[6-7, 10, 19]。盡管如此，生物催化進(jìn)行糖基化修飾還有很多制約因素需要深入研究，如活化的糖基供體供給、糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性及立體或位置選擇性問題。

為解決生物催化糖基化修飾過程中區(qū)域選擇性問題，提高催化底物活性可采用蛋白質(zhì)工程對糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行定向進(jìn)化工程改造[6, 20-21]，但是隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組等基因測序技術(shù)的發(fā)展，快速分離獲得具有功能多樣的糖基轉(zhuǎn)移酶依然是直接發(fā)現(xiàn)目標(biāo)糖基轉(zhuǎn)移酶最主要的策略，不僅如此，糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)工程也是基于功能鑒定的目標(biāo)基因基礎(chǔ)之上。因此，本研究依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果，從楊梅中分離鑒定了第一個糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT71AN1（GenBank：MK722191），經(jīng)過在大腸桿菌中異源表達(dá)和純化獲得目標(biāo)蛋白，然后在體外建立生物酶促催化反應(yīng)進(jìn)行功能鑒定，已通過 HPLC 和 HR-ESI-MS 分析證實(shí)了其能催化多個黃酮類化合物的糖基化，并確定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷鍵結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明 UGT71AN1 與 NP_001280899（UGT71K1）和 D3UAG2（UGT71K2）具有較高的氨基酸序列一致性并聚類在一個亞家族，位置選擇性與進(jìn)化聚類的結(jié)果一致[17-18]。

Figure 4 Enzymatic reaction of UGT71AN1 and relative enzymatic activities (A: Diagrammatic sketch of catalytic reaction of glycosylation reaction; B: Biotransformation of flavones into respective glucosides using the enzyme UGT71AN1)

Figure 5 Glucosylation of quercetin through enzymatic reaction and the characterization of corresponding glucoside product [A: HPLC analysis of reaction products (1: The reaction with quercetin, UDP-glucose and the purified UGT71AN1; 2: The negative reaction without the purified UGT71AN1); B: HR-ESI-MS analysis of glucoside]

圖 6 槲皮素-3'-O-葡萄糖苷全細(xì)胞生物催化動力學(xué)

Figure 6 Time course for the production of quercetin-3'-O-glucoside in engineered strain

通過對催化底物的結(jié)構(gòu)對比分析，盡管山奈酚和棕矢車菊素沒有 3'-O-羥基，查爾酮類異甘草素對應(yīng)的芳環(huán)上也沒有 3-O-羥基，但是 UGT71AN1 對這幾個黃酮類化合物依然都有很好的催化活性，說明該酶具有較廣泛的羥基化位點(diǎn)選擇性，這些糖苷的結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步進(jìn)行糖苷化產(chǎn)物的制備和結(jié)構(gòu)鑒定。為探索其全細(xì)胞催化的可行性，我們把含有催化 UDP-葡萄糖合成的 2 個關(guān)鍵酶與 UGT71AN1 進(jìn)行共誘導(dǎo)表達(dá)，通過外源添加槲皮素實(shí)現(xiàn)了槲皮素-3'-O-葡萄糖的全細(xì)胞生物催化合成。上述研究結(jié)果為從楊梅中分離鑒定更多的糖基轉(zhuǎn)移酶和把這些糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用于其他黃酮類或其他天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾提供了實(shí)踐借鑒。

[1] Vogt T, Jones P. Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: characterization of a supergene family. Trends Plant Sci, 2000, 5(9):380-386.

[2] Choi SH, Kim HS, Yoon YJ, et al. Glycosyltransferase and its application to glycodiversification of natural products. J Ind Eng Chem, 2012, 18(4):1208-1212.

[3] Tiwari P, Sangwan RS, Sangwan NS. Plant secondary metabolism linked glycosyltransferases: An update on expanding knowledge and scopes. Biotechnol Adv, 2016, 34(5):714-739.

[4] Thuan NH, Sohng JK. Recent biotechnological progress in enzymatic synthesis of glycosides. J Ind Microbiol Biotechnol, 2013, 40(12): 1329-1356.

[5] Liang DM, Liu JH, Wu H, et al. Glycosyltransferases: mechanisms and applications in natural product development. Chem Soc Rev, 2015, 44(22):8350-8374.

[6] Chen D, Chen R, Xie K, et al. Biocatalytic C-glucosylation of coumarins using an engineered C-glycosyltransferase. Org Lett, 2018, 20(6):1634-1637.

[7] Wang HM, Yang Y, Lin L, et al. Engineering Saccharomyces cerevisiae with the deletion of endogenous glucosidases for the production of flavonoid glucosides. Microb Cell Fact, 2016, 15(1):134.

[8] Kim HJ, Kim BG, Ahn JH. Regioselective synthesis of flavonoid bioglycosides using Escherichia coli harboring two glycosyltransferases. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(12):5275- 5282.

[9] He XZ, Li WS, Blount JW, et al. Regioselective synthesis of plant (iso)flavone glycosides in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80(2):253-260.

[10] Yang Y, Wang HM, Tong YF, et al. Systems metabolic engineering of Escherichia coli to enhance the production of flavonoid Glucuronides. RSC Adv, 2016, 6(40):33622-33630.

[11] Sun C, Huang H, Xu C, et al. Biological activities of extracts from Chinese bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.): a Review. Plant Foods Hum Nutr, 2013, 68(2):97-106.

[12] Juang LJ, Gao XY, Mai ST, et al. Safety assessment, biological effects, and mechanisms of Myrica rubra fruit extract for anti-melanogenesis, anti-oxidation, and free radical scavenging abilities on melanoma cells. J Cosmet Dermatol, 2019, 18(1):322-332.

[13] Kim HH, Kim DH, Kim MH, et al. Flavonoid constituents in the leaves of Myrica rubra sieb. et zucc. with anti-inflammatory activity. Arch Pharm Res, 2013, 36(12):1533-1540.

[14] Liu H, Qi X, Cao S, et al. Protective effect of flavonoid extract from Chinese bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.) fruit on alcoholic liver oxidative injury in mice. J Nat Med, 2014, 68(3):521-529.

[15] Mackenzie PI, Owens IS, Burchell B, et al. The UDP glycosyltransferase gene superfamily: recommended nomenclature update based on evolutionary divergence. Pharmacogenetics, 1997, 7(4):255-269.

[16] Cosch C, Halbwirth H, Schneider B, et al. Cloning and heterologous expression of glycosyltransferases from Malus x domestica and Pyrus communis, which convert phloretin to phloretin 2'-O-glucoside (phloridzin). Plant Sci, 2010, 178(3):299-306.

[17] Okitsu N, Matsui K, Horikawa M, et al. Identification and characterization of novel Nemophila menziesii flavone glucosyltransferases that catalyze biosynthesis of flavone 7,4'-O-diglucoside, a key component of blue metalloanthocyanins. Plant Cell Physiol, 2018, 59(10):2075-2085.

[18] Hu Y, Walker S. Remarkable structural similarities between diverse glycosyltransferases. Chem Biol, 2002, 9(12):1287-1296.

[19] De Bruyn F, Maertens J, Beauprez J, et al. Biotechnological advances in UDP-sugar based glycosylation of small molecules. Biotechnol Adv, 2015, 33(2):288-302.

[20] McArthur JB, Chen X. Glycosyltransferase engineering for carbohydrate synthesis. Biochem Soc Trans, 2016, 44(1):129-142.

[21] Kim HS, Kim BG, Sung S, et al. Engineering flavonoid glycosyltransferases for enhanced catalytic efficiency and extended sugar-donor selectivity. Planta, 2013, 238(4):683-693.

Identification and characterization of glucosyltransferaseUGT71AN1 from

TANG Ming-jia, YANG Yan, WANG Yu, LIU Min-zhi, WANG Wei

Author Affiliation: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health Commission of the People's Republic of China, Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

To identify and characterize a novel glucosyltransferase from, and further test its biocatalytic regio-specificity and apply it to conduct the glycosylation modification of natural products.

Basedon the results of transcriptome analysis of, the candidate Unigene was firstly selected. A cDNA clone encoding a uridine diphosphate (UDP) glucotransferase was amplified by RT-PCR and then inserted into an expression vector pTWIN1b. It was heterologously expressed inTransetta (DE3), and its enzymatic activities was examinedby enzymatic bioconversion and whole-cell biocatalysis.

A novel gene encoding UDP-glucotransferase was cloned by RT-PCR usingcDNAs as templates according to the selected candidate Unigene sequence, based on the results of transcriptome analysis. And then it was functionally named asby the Carbohydrate-Active Enzymes Database based on the identity to the other glycosyltransferases. It was successfully expressed inTransetta (DE3) and purified. Its enzymatic activities were employed and six flavonoids such as quercetin, kaempferol, (S)-eriodictyol, isoliquiritigenin, butein, and jaceosidin were observed to be glucosylated. Their corresponding glucosides were identified by HR-ESI-MS. Among them, the glucosidic bond quercetin-3'-O-glucoside was verified by1H- and13C-NMR spectra.

The multi-function UDP-glucosyltransferase UGT71AN1 catalyzing the glucosylation of flavonoids was characterized fromleaves, and it can be further used to catalyze the glycosylation of the other flavonoids through enzymatic or whole-cell biocatalysis.

Glycosyltransferases;; Biocatalysis; Flavonoid glycosides

WANG Wei, Email: wwang@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.001

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項目（2016-I2M- 3-012、2017-I2M-1-011）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX 09711001-006）

王偉，Email：wwang@imm.ac.cn

2019-04-23