韓玉澤，田崢，鐘雷

基于NLRP3信號通路探討活血通脈顆粒對急性心肌梗死大鼠免疫炎癥紊亂的干預(yù)作用

韓玉澤，田崢，鐘雷

116001 遼寧，大連市友誼醫(yī)院心內(nèi)二科（韓玉澤）；116001 遼寧，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科（田崢）；116001 遼寧，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（鐘雷）

探討活血通脈顆粒對急性心肌梗死（AMI）大鼠在免疫炎癥紊亂的干預(yù)作用。

大鼠 42 只隨機(jī)選 6 只為空白對照組，其余 36 只大鼠 AMI 造模。建模后存活大鼠 30 只隨機(jī)分成 5 組，陽性藥物對照組，AMI 組，活血通脈顆粒低、中、高劑量組，每組 6 只。空白對照組、AMI 組每天灌胃生理鹽水，陽性藥物對照組 184 mg/(kg·d) 灌胃辛伐他汀，活血通脈顆粒低、中、高劑量組按生藥 2.7、5.4、10.8 g/(kg·d) 灌胃，每日 1 次，連續(xù) 28 d。同時建立人 H9C2 心肌細(xì)胞缺氧模型，缺氧處理 21 h，加藥處理。HE 染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化；MTS 檢測心肌細(xì)胞活力變化；ELISA 檢測心肌組織和心肌細(xì)胞中 IL-1β、TNF-α 水平；qRT-PCR 檢測心肌組織中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）、接頭蛋白 ASC（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶 1（caspase-1）mRNA 水平；蛋白免疫印跡檢測心肌組織中NLRP3、ASC、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（pro-caspase-1）、caspase-1 蛋白水平。

大鼠和人心肌細(xì)胞模型中，AMI 組心肌細(xì)胞破壞、死亡嚴(yán)重，形態(tài)及結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重。隨著活血通脈顆粒劑量的增加，心肌細(xì)胞壞死現(xiàn)象減弱，逐漸恢復(fù)形態(tài)。大鼠模型中，與空白對照組相比，AMI 組心肌組織中IL-1β、TNF-α、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 和蛋白、pro-caspase-1 蛋白表達(dá)量升高（< 0.05）。與AMI 組相比，活血通脈顆粒低劑量組心肌組織中ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量降低；活血通脈顆粒中、高劑量組心肌組織中IL-1β、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 和蛋白、pro-caspase-1 蛋白表達(dá)量降低，并呈劑量依賴效應(yīng)（< 0.05）。人心肌細(xì)胞中加藥 6 h 時 IL-1β、TNF-α 的變化與大鼠模型中類似。

活血通脈顆?？赡芡ㄟ^減弱 NLRP3 信號通路、抑制促炎因子表達(dá)，實現(xiàn)對 AMI 大鼠的保護(hù)作用。

心肌梗死； 活血通脈顆粒； 免疫炎癥； 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3 信號通路

急性心肌梗死（acute myocardium infarction，AMI）是持續(xù)性缺血缺氧引起的心肌壞死，近年來國內(nèi)患病人數(shù)至少有 350 萬，呈明顯上升趨勢。其主要臨床特點是起病急、病死率高[1]。目前西藥治療AMI 會使患者出現(xiàn)惡心、腹瀉、消化不良、瘙癢、肌痛、胰腺炎、感覺異常、外周神經(jīng)病變、嘔吐和貧血等諸多不良反應(yīng)[2]，因此尋找安全有效、副作用少的中藥引起重視?；钛}顆粒由多種中藥配制而成，有改善缺氧狀況及循環(huán)障礙、降血壓、抑制血小板聚集等作用，在動物模型中，可緩解頸動脈粥樣硬化兔炎癥因子表達(dá)水平[3]。在臨床上，可改善真性紅細(xì)胞增多癥患者凝血功能從而達(dá)到治療疾病目的[4]，但具體作用機(jī)制尚不明確。AMI 中大麻素受體 2 可抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）/接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a caspase activation and recruitment domain，ASC）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（cysteinyl aspartate-specific protease-1，pro-caspase-1）信號通路從而抑制炎癥反應(yīng)以減少心肌梗死[5]，但活血通脈顆粒對 AMI 大鼠和人心肌細(xì)胞作用尚未見報道。本研究建立 AMI 大鼠模型，觀察活血通脈顆粒對AMI 大鼠心肌損傷的作用及對 NLRP3 信號通路的影響并建立人心肌細(xì)胞模型驗證大鼠模型結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 清潔級健康 SD 大鼠，雄性，重量 200 ~ 220 g，購自中科英?？萍加邢薰荆S可證號：SCXK-2016-0167。飼養(yǎng)于（25 ± 1）℃、（50 ± 10）% 濕度、12 h 黑暗 12 h 光照的實驗動物中心，所有實驗均經(jīng)本院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)；人 H9C2 心肌細(xì)胞購自美國 ATCC，貨號：GD-C3218858。

1.1.2 藥物 活血通脈顆粒由紅景天、陳皮、茯苓、紅花、生地、赤芍等組成，在云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房購買并配制；辛伐他汀片購自成都華宇制藥有限公司，批號：H005227。

1.1.3 試劑與儀器 蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、蛋白裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠 IL-1β、TNF-α、人 IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒，一抗 NLRP3（抗兔）、ASC（抗兔）、pro-caspase-1（抗兔）、caspase-1（抗兔）、內(nèi)參 GADPH（抗鼠）、二抗羊抗兔、羊抗鼠均購自英國 Abcam 公司；Trizol 購自中國賽默飛世爾科技有限公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2 × SYBR Premix Ex TaqTMII Probe QPCR Mix 購自美國 Fermentas 公司；DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清購自以色列 BI 公司；MTS 溶液購自上海貝博生物科技公司；FPMIC-razoII 型切片機(jī)購自德國Leica 公司；UIS2 型普通光學(xué)顯微鏡購自日本 Olympus 公司；4376600 型實時熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI公司；E-Gel174 型蛋白凝膠成像儀購自美國 Invitrogen 公司；4700 型酶標(biāo)儀購自美國 Awareness 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行動物造模。42 只大鼠隨機(jī)選 6 只為空白對照組，其余 36 只大鼠造模。10% 水合氯醛（4 ml/kg）對大鼠腹腔麻醉，氣管插管并接呼吸機(jī)、心電圖機(jī)，大鼠左側(cè)胸骨備皮并消毒，3 ~ 4 肋間分離肌肉組織、快速擠出心臟，左冠狀動脈前降支下 2 ~ 3 mm 處結(jié)扎，待左室前壁部分心肌變白、局部收縮減弱，心電圖II 導(dǎo)聯(lián) ST 段較術(shù)前抬高 0.2 mV 以上即為造模成功。造模成功后立即縫合。術(shù)后連續(xù) 3 d 肌肉注射 4 萬單位青霉素，預(yù)防傷口感染。造模過程中大鼠死亡 6 只，存活 30 只。

1.2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為陽性藥物對照組，AMI 組，活血通脈顆粒低、中、高劑量組，每組 6 只。陽性對照組灌胃 184 mg/(kg·d)辛伐他汀[7]；空白對照組、AMI 組每天灌胃生理鹽水；根據(jù)臨床用藥劑量，常用實驗動物及人的表面積比例，活血通脈顆粒低（2.7 g生藥/kg）、中（5.4 g生藥/kg）、高（10.8 g生藥/kg）劑量組予以相應(yīng)劑量藥物[8]。連續(xù)灌胃 4 周。

1.2.3 HE 染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化 灌胃結(jié)束第二天，所有大鼠腹腔麻醉，立即打開胸腔分離心臟組織，部分組織–20℃冰箱凍存，部分–80℃冰箱凍存，其余放于 4% 多聚甲醛中。

固定于 4% 多聚甲醛中的組織過夜后至酒精中脫水，二甲苯中透明，石蠟包埋，冷凍凝固后切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡拍照。

1.2.4 ELISA 檢測大鼠心肌組織中 IL-1β、TNF-α 水平 用–20℃冰箱凍存的組織制備組織勻漿，5000 r/min 離心 5 min，收集上清后分裝待測。按照大鼠 IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5 qRT-PCR 檢測大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 水平 –80℃冰箱中每個樣品取部分組織，Trizol 法提取心肌組織總 RNA，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄 cDNA，qRT-PCR 儀對 NLRP3、ASC、caspase-1、GADPH 擴(kuò)增。引物序列見表 1。擴(kuò)增體系：cDNA 1 μl（50 ng/μl），F(xiàn)/R（10 μmol/L）各0.5 μl，2 × SYBR Premix Ex TaqTMII Probe QPCR Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s；95 ℃ 60 s，62 ℃ 55 s，45 個循環(huán)。2-??CT法對心肌組織中 NLRP3、ASC、caspase-1、GADPH 表達(dá)水平定量分析。

表 1 qRT-PCR 引物序列

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白水平 –80 ℃冰箱中每個樣品取部分組織，在冰上研磨，每管加1 ml 蛋白裂解液冰上裂解 30 min，提取心肌組織總蛋白，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜；5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h；對應(yīng)加入一抗NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、GADPH，4 ℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育 1 h。DAB 顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出人 H9C2 心肌細(xì)胞，添加 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至 80% 時做后續(xù)實驗。

1.2.8 細(xì)胞活力鑒定 實驗前分別將辛伐他汀、水煎后的活血通脈顆粒過濾濃縮成 100 ml 定容。放入–20 ℃冰箱中梯度降溫至–80 ℃，最后制成干粉，辛伐他汀相當(dāng)于368 mg/100 ml、活血通脈顆粒相當(dāng)于21.6 g生藥/100 ml。10% FBS DMEM 培養(yǎng)液將上述干粉分別稀釋成 1 ml 儲備液，分裝至–20 ℃冰箱備用。陽性藥物對照組按（儲備液:10% FBS DMEM 培養(yǎng)液 = 1:1），活血通脈顆粒各劑量組分別按低（儲備液:10% FBS DMEM 培養(yǎng)液 = 1:7）、中（儲備液:10% FBS DMEM 培養(yǎng)液 = 1:3）、高（儲備液:10% FBS DMEM 培養(yǎng)液 = 1:1）稀釋備用。

生長良好的細(xì)胞制成 5 × 104個/ml 懸浮液至 96 孔板中，每孔 100 μl 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。參考文獻(xiàn)[9]，部分 96 孔板放入 95% N2、5% CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng) 21 h，對應(yīng)位置分別加入辛伐他汀、活血通脈顆粒低、中、高劑量稀釋液，AMI 組加 10% FBS DMEM 培養(yǎng)液；部分 96 孔板常規(guī)同樣培養(yǎng) 21 h，加 10% FBS DMEM 培養(yǎng)液設(shè)為空白對照組，每孔 100 μl。所有 96 孔板分別在培養(yǎng) 0、3、6、9 h 時每孔加 10 μl MTS 溶液，37 ℃孵育3 h，酶標(biāo)儀 490 nm 處測吸光度（）。細(xì)胞存活率=[1 –（空白組–實驗組）/空白組]× 100%。每孔設(shè)置 6 個重復(fù)。

1.2.9 ELISA 檢測大鼠心肌細(xì)胞中 IL-1β、TNF-α 水平 6 孔板常規(guī)培養(yǎng)人 H9C2 心肌細(xì)胞，至細(xì)胞密度 80% ~ 90% 時部分按 1.2.8 缺氧造模方法處理細(xì)胞 21 h 后對應(yīng)加藥，AMI 組加 10% FBS DMEM 培養(yǎng)液；空白對照組常規(guī)培養(yǎng) 21 h 加 10% FBS DMEM 培養(yǎng)液，所有 6 孔板都常規(guī)培養(yǎng)6 h 后收集細(xì)胞。按照人 IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒說明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠組織形態(tài)學(xué)變化

空白對照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核分布單一。陽性藥物對照組部分細(xì)胞細(xì)胞核破碎、局部核消失，部分血管可見中性粒細(xì)胞顆粒浸潤現(xiàn)象。AMI 組心肌細(xì)胞凝固性死亡嚴(yán)重，大部分細(xì)胞膜碎裂并溶解，細(xì)胞質(zhì)染色較深，血管充血明顯、間充質(zhì)水腫并伴有大量中性粒細(xì)胞顆粒浸潤細(xì)胞現(xiàn)象明顯?；钛}顆粒低、中、高劑量組隨著劑量的增加，心肌細(xì)胞凝固性壞死現(xiàn)象減弱，梗塞逐漸不明顯，細(xì)胞核固縮、腫脹或溶解現(xiàn)象減緩，細(xì)胞質(zhì)染色變深、細(xì)胞體積變大現(xiàn)象減弱，血管充血、間充質(zhì)水腫和神經(jīng)營養(yǎng)細(xì)胞浸潤癥狀逐漸減弱（圖 1）。

2.2 各組大鼠心肌組織中 IL-1β、TNF-α 表達(dá)量變化

與空白對照組相比，AMI 組、活血通脈顆粒低劑量組心肌組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量升高，陽性藥物對照組，活血通脈顆粒中、高劑量組心肌組織中TNF-α 表達(dá)量升高（< 0.05）。與陽性藥物對照組相比，AMI 組、活血通脈顆粒低劑量組心肌組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量升高，活血通脈顆粒中劑量組心肌組織中TNF-α 表達(dá)量升高（< 0.05）。與AMI 組相比，活血通脈顆粒中劑量組心肌組織中IL-1β 表達(dá)量降低，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒低劑量組相比，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒中劑量組相比，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中TNF-α 表達(dá)量降低（< 0.05）（表 2）。

2.3 各組大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達(dá)量變化

與空白對照組相比，陽性藥物對照組心肌組織中 NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。與空白對照組、陽性藥物對照組相比，AMI 組，活血通脈顆粒低、中劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達(dá)量升高，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中NLRP3 mRNA 表達(dá)量升高、caspase-1 mRNA 表達(dá)量降低（< 0.05）。與AMI 組相比，活血通脈顆粒中、高劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒低劑量組相比，活血通脈顆粒中劑量組心肌組織中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)量降低，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒中劑量組相比，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中ASC、caspase-1 mRNA 表達(dá)量降低（< 0.05）（表 3）。

圖 1 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化（圓圈表示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和炎癥細(xì)胞滲透部位，200 ×）

Figure 1 Morphological changes of myocardium in rats (circle indicates destruction of cell structure and infiltration site of inflammatory cells, 200 ×)

表 2 各組大鼠心肌組織中 IL-1β、TNF-α 表達(dá)量變化（n = 6，）

注：與空白對照組相比，a< 0.05；與陽性藥物對照組相比，b< 0.05；與 AMI 組相比，c< 0.05；與低劑量組相比，d< 0.05；與中劑量組相比，e< 0.05。

Notes: Compared with the blank control group,a< 0.05; Compared with positive drug control group,b< 0.05; Compared with AMI group,c< 0.05; Compared with the low dose group,d< 0.05; Compared with the middle dose group,e< 0.05.

2.4 各組大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量變化

與空白對照組相比，陽性藥物對照組心肌組織中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。與空白對照組、陽性藥物對照組相比，AMI 組、活血通脈顆粒低劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量升高，活血通脈顆粒中劑量組心肌組織中ASC、pro-caspase-1 蛋白表達(dá)量升高，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)量降低（< 0.05）。與AMI 組相比，活血通脈顆粒低劑量組心肌組織中ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量降低，活血通脈顆粒中、高劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒低劑量組相比，活血通脈顆粒中劑量組心肌組織中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量降低，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量下降（< 0.05）。與活血通脈顆粒中劑量組相比，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量下降（< 0.05）（圖 2 和表 4）。

表 3 各組大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 相對表達(dá)量變化（n = 6，）

注：與空白對照組相比，a< 0.05；與陽性藥物對照組相比，b< 0.05；與 AMI 組相比，c< 0.05；與低劑量組相比，d< 0.05；與中劑量組相比，e< 0.05。

Notes: Compared with the blank control group,a< 0.05; Compared with positive drug control group,b< 0.05; Compared with AMI group,c< 0.05; Compared with the low dose group,d< 0.05; Compared with the middle dose group,e< 0.05.

圖 2 各組大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量變化

Figure 2 Changes of expression of NLRP3, ASC, pro-caspase-1 and caspase-1 in myocardium of rats in each group

表 4 各組大鼠心肌組織中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量變化（n = 6，）

注：與空白對照組相比，a< 0.05；與陽性藥物對照組相比，b< 0.05；與 AMI 組相比，c< 0.05；與低劑量組相比，d< 0.05；與中劑量組相比，e< 0.05。

Notes: Compared with the blank control group,a< 0.05; Compared with positive drug control group,b< 0.05; Compared with AMI group,c< 0.05; Compared with the low dose group,d< 0.05; Compared with the middle dose group,e< 0.05.

2.5 各組人心肌細(xì)胞活力鑒定

H9C2 細(xì)胞藥物處理 0 h 時，與空白對照組相比，陽性藥物對照組，AMI 組，活血通脈顆粒低、中、高劑量組細(xì)胞存活率降低（< 0.05）。藥物處理 3 h 時，與空白對照組相比，陽性藥物對照組，AMI 組，活血通脈顆粒低、中、高劑量組細(xì)胞存活率降低（< 0.05）；與陽性藥物對照組相比，AMI 組、活血通脈顆粒低劑量組細(xì)胞存活率降低（< 0.05）。藥物處理 6、9 h 時，與空白對照組相比，陽性藥物對照組，AMI 組，活血通脈顆粒低、中、高劑量組細(xì)胞存活率降低（< 0.05）；與陽性藥物對照組相比，AMI 組，活血通脈顆粒低、中劑量組細(xì)胞存活率降低（< 0.05）；與 AMI 組相比，活血通脈顆粒低、中、高劑量組細(xì)胞存活率升高（< 0.05）；與活血通顆粒低劑量組相比，活血通脈顆粒中、高劑量組細(xì)胞存活率升高（< 0.05）；與活血通顆粒中劑量組相比，活血通脈顆粒高劑量組細(xì)胞存活率升高（< 0.05）（表 5）。

2.6 各組人心肌細(xì)胞藥物處理形態(tài)

空白對照組細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞貼壁分布均勻、連接緊密、且密度較大。與空白對照組相比，陽性藥物組細(xì)胞皺縮、密度減少；AMI 組細(xì)胞皺縮嚴(yán)重、部分細(xì)胞變圓形、細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞死亡明顯；活血通脈顆粒藥物干預(yù)后，隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞密度逐漸增大，形態(tài)逐步改善（圖 3）。

2.7 各組人心肌細(xì)胞中 IL-1β、TNF-α 水平

與空白對照組相比，陽性對照組、活血通脈顆粒高劑量組心肌細(xì)胞中IL-1β 表達(dá)量升高，AMI 組，活血通脈顆粒低、中劑量組心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量升高（< 0.05）。與陽性藥物對照組相比，AMI 組、活血通脈顆粒低劑量組心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量升高，活血通脈顆粒中劑量組心肌細(xì)胞中TNF-α 表達(dá)量升高（< 0.05）。與AMI 組相比，活血通脈顆粒中、高劑量組心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒低劑量組相比，活血通脈顆粒中、高劑量組心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α 表達(dá)量降低（< 0.05）。與活血通脈顆粒中劑量組相比，活血通脈顆粒高劑量組心肌組織中TNF-α 表達(dá)量降低（< 0.05）（表 6）。

表 5 各組人 H9C2 細(xì)胞藥物處理不同時間細(xì)胞存活率（%，n = 6，）

注：與空白對照組相比，a< 0.05；與陽性藥物對照組相比，b< 0.05；與 AMI 組相比，c< 0.05；與低劑量組相比，d< 0.05；與中劑量組相比，e< 0.05。

Notes: Compared with the blank control group,a< 0.05; Compared with positive drug control group,b< 0.05; Compared with AMI group,c< 0.05; Compared with the low dose group,d< 0.05; Compared with the middle dose group,e< 0.05.

圖 3 各組人 H9C2 細(xì)胞藥物處理 6 h 時形態(tài)變化（200 ×）

Figure 3 Morphological changes of human H9C2 cells treated with drugs for 6 hours in each group (200 ×)

表 6 各組大鼠心肌細(xì)胞中 IL-1β、TNF-α 表達(dá)量變化（n = 6，）

注：與空白對照組相比，a< 0.05；與陽性藥物對照組相比，b< 0.05；與 AMI 組相比，c< 0.05；與低劑量組相比，d< 0.05；與中劑量組相比，e< 0.05。

Notes: Compared with the blank control group,a< 0.05; Compared with positive drug control group,b< 0.05; Compared with AMI group,c< 0.05; Compared with the low dose group,d< 0.05; Compared with the middle dose group,e< 0.05.

3 討論

AMI 發(fā)生常伴有心律失常、附壁血管形成、心力衰竭和心源性休克等一系列并發(fā)癥，是冠心病的嚴(yán)重類型，目前發(fā)生率和病死率都較高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[9]。尋找安全有效的治療方法迫在眉睫。本病屬中醫(yī)的“真心痛”、“厥心痛”范疇，其并發(fā)癥屬心悸、喘證、厥脫等范圍[10]。中藥治療 AMI 較安全且不易復(fù)發(fā)，銀杏內(nèi)酯 B 提高 AMI 患者射血分?jǐn)?shù)、益氣活血方可實現(xiàn) AMI 患者心肌重建，改善心肌缺血現(xiàn)狀[11-12]，活血通脈顆粒主要成分由紅景天、法半夏、陳皮、茯苓、甘草、桃仁、當(dāng)歸、川芎、麝香、紅花、生地、赤芍成分組成，在頸動脈粥樣硬化兔模型中可抑制促炎因子水平，進(jìn)而干預(yù)兔斑塊形成，達(dá)到治療兔頸動脈粥樣硬化目的[3]，但活血通脈顆粒在 AMI 大鼠中發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究建立大鼠AMI 模型，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細(xì)胞死亡，細(xì)胞膜碎裂，細(xì)胞質(zhì)染色較深，一些細(xì)胞細(xì)胞核消失，細(xì)胞因缺氧被破壞，但對心肌細(xì)胞的具體功能的影響尚不明確。活血通脈顆粒處理大鼠后，隨著劑量的增加，缺氧處理的大鼠癥狀逐漸減輕，細(xì)胞死亡癥狀逐漸減輕，細(xì)胞質(zhì)染色變淺、細(xì)胞間充質(zhì)水腫現(xiàn)象緩解，提示活血通脈顆?？删徑?AMI 造成的心肌細(xì)胞壞死、心肌梗死等癥狀。

IL-1β 是 IL-1 的主要分泌形式，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，在炎癥疾病中高表達(dá)會誘發(fā)炎癥機(jī)制，加重病情[13]，在 AMI 患者中高表達(dá)可加重 AMI 進(jìn)程[14]。TNF-α 是炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早、最重要的炎癥介質(zhì)、是炎性腸病中腸炎癥的中樞介質(zhì)[15]，在 AMI 患者中高表達(dá)破壞 AMI 生理過程，會使不良預(yù)后比例上升[16]。IL-1β 和 TNF-α 可反映 AMI 機(jī)體炎癥程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，AMI 組心肌組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)升高，提示 AMI 組心肌組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)升高可誘發(fā)炎癥機(jī)制、加重 AMI 進(jìn)程。與AMI 組相比，活血通脈顆粒低劑量組心肌組織中IL-1β、TNF-α 的變化不明顯，提示較低的藥物劑量可能對 AMI 的影響較??；但隨著活血通脈顆粒劑量的增加，心肌組織中IL-1β、TNF-α 的表達(dá)量逐漸降低，提示活血通脈顆粒可降低 AMI 引起的IL-1β、TNF-α 升高現(xiàn)象，并且隨著劑量的增加對 IL-1β、TNF-α 作用越強(qiáng)。

NLRP3 存在于細(xì)胞質(zhì)中，是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要成員，是 NLRs 家族成員之一，過度激活與 AMI 嚴(yán)重程度有關(guān)[17]。受損細(xì)胞釋放三磷酸腺苷和透明膠質(zhì)、斑塊β 淀粉樣蛋白纖維等多種因素均可激活NLRP3 炎癥體[18-20]。激活后的 NLRP3促進(jìn) ASC 募集并激活 caspase-1，活化的 caspase-1促進(jìn)機(jī)體分泌IL-1β 和 TNF-α，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)、炎癥細(xì)胞等在患病處堆積，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥并誘導(dǎo)細(xì)胞損傷嚴(yán)重時細(xì)胞壞死[21]。本研究發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，AMI 組心肌組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 和蛋白、pro-caspase-1蛋白表達(dá)量升高，提示 AMI 心肌組織中 NLRP3 炎癥體被激活從而促進(jìn) ASC 募集并激活 caspase-1，活化的 caspase-1 促進(jìn)相關(guān)炎癥因子的分泌進(jìn)而損壞心肌組織，加重 AMI 進(jìn)程。隨著活血通脈顆粒劑量的增加，AMI 大鼠心肌組織中NLRP3、caspase-1 mRNA 和蛋白、pro-caspase-1 蛋白表達(dá)量逐漸降低，呈劑量依賴性。提示活血通脈顆粒可能抑制AMI 心肌組織中 NLRP3 炎癥體激活，減少機(jī)體炎癥從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

以人心肌細(xì)胞為模型進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)缺氧處理 H9C2 心肌細(xì)胞，陽性藥物對照，活血通脈顆粒低、中、高劑量組后細(xì)胞活力降低；添加活血通脈顆粒，隨著藥物時間的延長細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)。在藥物處理 6 h 時，AMI 組細(xì)胞壁皺縮，死亡嚴(yán)重；隨著活血通脈顆粒劑量的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸改善，且細(xì)胞中IL-1β、TNF-α 水平與大鼠模型有類似結(jié)果。提示大鼠和人心肌細(xì)胞模型中，缺氧都會破壞心肌細(xì)胞，加重心肌細(xì)胞中炎癥因子水平，活血通脈顆粒劑量可減緩由缺氧造成的心肌細(xì)胞損傷狀態(tài)，同時減弱炎癥因子水平。

綜上所述，活血通脈顆粒通過抑制炎癥小體NLRP3/ASC/caspase-1 通路、降低IL-1β、TNF-α 炎癥因子水平進(jìn)而抑制心肌組織炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織炎癥損傷，實現(xiàn)對AMI 大鼠的心肌組織保護(hù)作用。

[1] Zhang L, Wang Z, Wang D, et al. CD8+CD28+T cells might mediate injury of cardiomyocytes in acute myocardial infarction. Mol Immunol, 2018, 101:74-79.

[2] Fu YJ, Liu ZN, Song YX. Clinical trial of metoprolol tartrate tablet in combination with simvastatin tablet in the treatment of coronary heart disease with angina pectoris. Chin J Clin Pharmacol, 2018, 34(8):922- 925. (in Chinese)

付盈菊, 劉志寧, 宋玉新. 酒石酸美托洛爾片聯(lián)合辛伐他汀片治療冠心病心絞痛的臨床研究. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2018, 34(8):922- 925.

[3] Xie J, Shen C, Tong XY, et al. Effects of Huoxue Tongmai granules on TLR4 signaling pathways and relevant inflammatory factor mrna expression of rabbits with atherosclerosis. Chin J Inf Traditional Chin Med, 2016, 23(3):47-50. (in Chinese)

謝健, 沈超, 童曉云, 等. 活血通脈顆粒對頸動脈粥樣硬化兔TLR4信號通路及相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)的影響. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2016, 23(3):47-50.

[4] Zang FJ, Wang SQ, Wang ND, et al. Effect of Huoxue Tongmai granule on K value in thromboelastogram in patients with polycythemia vera. J Anhui Univ Chin Med, 2017, 36(2):22-25. (in Chinese)

臧奉嬌, 王樹慶, 王念德, 等. 活血通脈顆粒對真性紅細(xì)胞增多癥患者血栓彈力圖K值的影響. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2017, 36(2): 22-25.

[5] Yu W, Jin G, Zhang J, et al. Selective activation of cannabinoid receptor 2 attenuates myocardial infarction via suppressing NLRP3 inflammasome. Inflammation, 2019, 42(3):904-914.

[6] Ke F, Zuo KK, Gu N. Effects of "GuanXin V" preparation on rats ventricular remodeling and inflammatory factors with acute myocardial infarction. J Basic Chin Med, 2016, 22(1):50-53. (in Chinese)

柯峰, 左可可, 顧寧. “冠心V號”制劑對急性心肌梗死模型大鼠心室重構(gòu)及炎癥因子的影響. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 22(1): 50-53.

[7] Dong GJ, Zhang QX, Liu JG, et al. Effects of component compatibility of Huoxue Jiedu herbs on inflammation level after acute myocardial infarction in different periods. Global Traditional Chin Med, 2018, 11(12):1857-1861. (in Chinese)

董國菊, 張慶祥, 劉劍剛, 等. 活血解毒中藥配伍對大鼠急性心肌梗死后不同時段炎癥水平的影響. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2018, 11(12):1857- 1861.

[8] Guan L, Yang GL, Zhang Z, et al. Study on main pharmacodynamics related to functions of Hexue Tongmai particles. Chin Arch Traditional Chin Med, 2014, 32(1):47-50. (in Chinese)

關(guān)樂, 楊關(guān)林, 張哲, 等. 和血通脈顆粒與功能主治有關(guān)的主要藥效學(xué)實驗研究. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2014, 32(1):47-50.

[9] Lei SP, Long ZJ, Shi H, et al. Protection of Polygonatum sibiricum polysaccharides on H9c2 myocardial cells injury induced by hypoxia-reoxygenation. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2017, 33(1): 102-106. (in Chinese)

雷升萍, 龍子江, 施慧, 等. 黃精多糖對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用. 中藥藥理與臨床, 2017, 33(1):102-106.

[10] Feng XZ, Diao J, Fang T, et al. Effects of traditional Chinese medicine on myocardial reperfusion and cardiac function in patients with myocardial infarction treated by interventional therapy. Chin Arch Traditional Chin Med, 2018, 36(11):2760-2763. (in Chinese)

馮小智, 刁杰, 方婷, 等. 中醫(yī)辨證治療對行介入療法的急性心肌梗死患者心肌再灌注和心功能的改善作用. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2018, 36(11):2760-2763.

[11] Jiang JH, Deng QH, Gao YY. Effects of ginkgolide B on the ventricular wall motion of patients with acute myocardial infarction after revascularization. Chin Traditional Patent Med, 2018, 40(2):294- 299. (in Chinese)

江家華, 鄧慶華, 高于英. 銀杏內(nèi)酯B對急性心肌梗死患者血運重建后心室壁運動的影響. 中成藥, 2018, 40(2):294-299.

[12] Wu JN, Guo SW, Qi X, et al. Effects of Yiqi Huoxue Formula on capillary morphology and VEGFR-2 and HIF-1α expression in ischemic myocardium in myocardial infarction rats model. ChinaJ Traditional Chin Med Pharm, 2018, 33(5):1886-1890. (in Chinese)

吳佳妮, 郭書文, 齊欣, 等. 益氣活血方對心肌梗死大鼠心肌毛細(xì)血管形態(tài)及VEGFR-2和HIF-1α的影響. 中華中醫(yī)藥雜志, 2018, 33(5):1886-1890.

[13] Ma T, Liu X, Cen Z, et al. MicroRNA-302b negatively regulates IL-1β production in response to MSU crystals by targeting IRAK4 and EphA2. Arthritis Res Ther, 2018, 20(1):34.

[14] Yu Y, Jin L, Zhuang Y, et al. Cardioprotective effect of rosuvastatin against isoproterenol-induced myocardial infarction injury in rats. Int J Mol Med, 2018, 41(6):3509-3516.

[15] Maolake A, Izumi K, Natsagdorj A, et al.Tumor necrosis factor-α induces prostate cancer cell migration in lymphatic metastasis through CCR7 upregulation. Cancer Sci, 2018, 109(5):1524-1531.

[16] Wang YX, Lu YP. IL-8, IL-1, the role of TNF alpha in AMI and significance. Med Front, 2015, 5(2):7-8. (in Chinese)

王禹雪, 陸永萍. 白介素-8、白介素-1、TNF-α在AMI中的作用及意義. 醫(yī)藥前沿, 2015, 5(2):7-8.

[17] Westerterp M, Fotakis P, Ouimet M, et al. Cholesterol efflux pathways suppress inflammasome activation, NETosis and atherogenesis. Circulation, 2018, 138(9):898-912.

[18] Li R, Wang J, Li R, et al. ATP/P2X7-NLRP3 axis of dendritic cells participates in the regulation of airway inflammation and hyper-responsiveness in asthma by mediating HMGB1 expression and secretion. Exp Cell Res, 2018, 366(1):1-15.

[19] Christ A, Günther P, Mar L, et al. Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming. Cell, 2018, 172(1-2):162-175, e14.

[20] Fekete C, Vastagh C, Dénes á, et al. Chronic amyloid β oligomer infusion evokes sustained inflammation and microglial changes in the rat hippocampus via NLRP3. Neuroscience, 2019, 405:35-46.

[21] Xu F, Ji Q, Zhang J, et al. AlCl3 inhibits LPS-induced NLRP3 inflammasome activation and IL-1β production through suppressing NF-κB signaling pathway in murine peritoneal macrophages. Chemosphere, 2018, 209:972-980.

Intervention effect of Huoxue Tongmai Granule on immune inflammation disorders in acute myocardial infarction rats based on NLRP3 signaling pathway

HAN Yu-ze, TIAN Zheng, ZHONG Lei

Author Affiliations: Department of Cardiology, Dalian Friendship Hospital, Liaoning 116001, China (HAN Yu-ze); Department of Cardiology, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Liaoning 116001, China (TIAN Zheng); Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Dalian Meidcal University, Liaoning 116001, China (ZHONG Lei)

To investigate the effect of Huoxue Tongmai Granule (HXTMG) on immune inflammation disorders in rats with acute myocardial infarction (AMI).

Six from forty-two rats were randomly selected as blank control group, and the rest thirty-six rats were made as models by AMI. Thirty surviving rats were randomly divided into five groups: positive drug control group, AMI group, low, middle and high-dose HXTMG groups, with six rats in each group. The blank control group and the AMI group were given normal saline daily for intragastric administration. The positive drug control group was given 184 mg/(kg·d) of simvastatin for intragastric administration, and the low, medium and high-dose HXTMG groups were given 2.7, 5.4, 10.8 g/(kg·d) of crude drug, respectively, once a day for 28 days. Human hypoxia model of H9C2 cardiomyocytes was established, and treated with hypoxia for 21 h, followed by treatment with drugs. HE staining was used to observe the histomorphological changes of myocardium. MTS was used to detect changes in myocardial cell viability. The levels of IL-1β and TNF-α in myocardium were detected by ELISA. Quantitative RT-PCR was used to detect the levels of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3), apoptosis-associated speck-like proteincontain a caspase activation and recruitment domain (ASC), and cysteinyl aspartate specific proteinase 1 (caspase-1) mRNA in myocardium. The levels of NLRP3, ASC, cysteine-containing aspartate-specific-1 protease (pro-caspase-1) and caspase-1 proteins in myocardium were detected by Western blot.

In the rat and cardiomyocyte models, the AMI group was severely damaged, with significant morphological and structural damages. With the increase of dose of HXTMG, the necrosis of myocardial cells is weakened and the morphology is gradually restored. In the rat model, expressions of IL-1β, TNF-α, NLRP3, ASC, caspase-1 mRNA and protein along with pro-caspase-1 protein in the myocardium of AMI group was increased as compared with the blank control group, (< 0.05). Compared with the AMI group, expressions of ASC, pro-caspase-1 and caspase-1 protein in the myocardium of low-dose HXTMG group was decreased. Also, expressions of IL-1β, NLRP3, ASC, caspase-1 mRNA and protein, and pro-caspase-1 protein in the myocardium of middle-dose HXTMG group was decreased. In addition to the changes similar as middle-dose HXTMG group, the expressions TNF-α mRNA and protein were further decreased in the high-dose HXTMG group (< 0.05). With the increase of HXTMG dose, the expressions of above stated pro-inflammatory factors changed in a dose-dependent manner (< 0.05). The changes of IL-1β and TNF-α in the human cardiomyocytes were similar as those in the rat model at 6 h.

Huoxue Tongmai Granule may protect AMI injury by attenuating the NLRP3 signaling pathway and inhibit the expression of pro-inflammatory cytokines.

Myocardial infarction; Huoxue Tongmai Granule; Immune inflammation; Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 signaling pathway

HAN Yu-ze, Email: hzr523326@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.008

韓玉澤，Email：hzr523326@sina.com

2019-03-26